【正文】 tract ， 1%NaCl， pH ） （ 17） LB/AMP 培養(yǎng)基 （ 1%（ W/V） Trytone， % Yeast Extract ， 1%NaCl， Ampicillin （ 18） SOB 培養(yǎng)基 （ 2%（ W/V） Trytone， % Yeast Extract ， %NaCl， KCl， 10mM MgCl） 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) （ 19） SOC 培養(yǎng)基 （ 2%（ W/V） Trytone， % Yeast Extract ， %NaCl， KCl， 10mM MgCl， 20ｍ M 葡萄糖 （ 20） TB 溶液 Transformation Buffer HEPES 10mM， 15mM， KCl 250mM，加入蒸餾水 950ml， 用 5M KOH 調(diào) PH 至 ，低 PH 不溶 ， 在加終濃度 為 55mM 的 ， 定溶到 1L, 過濾滅菌 , 4 度保存 。 DEPC 水定容至 1L。 d1【 32】 。 m2 2 材料與方法 材料 植物材料的培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用材料為 小果 白刺 （ Nitraria sibirica Pall.），別名 西伯利亞白刺 【 31】 ， 實(shí)驗(yàn)室快繁試管苗（陳貴林教授贈(zèng)予 ），培養(yǎng)基為 1/2MS+IBA mg/L+50mM NaCL, 溫度為 (25177。 Actin 基因是管家基因之一，在各種不同器官上恒定表達(dá)，因而它可以用作分子內(nèi)標(biāo)來研究其它基因的表達(dá)差異。④表達(dá)水平與細(xì)胞周期及細(xì) 胞是否活化無關(guān) 。②穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織中，而且其表達(dá)量無顯著性差別等條件，高度或中度表達(dá)，但不是太高或低表達(dá) 。植物肌動(dòng)蛋白通常由 376377 個(gè)氨基酸組成，肌動(dòng)蛋白利用其分子表面與很多肌動(dòng)結(jié)合蛋白發(fā)生相互作用，植物肌動(dòng)蛋白具有高度保守性。本研究中我選擇了生于輕度鹽漬化低地、湖盆邊緣、干河床邊，可作為優(yōu)勢(shì)種并形成群落的小果白刺。他們通過雙向電泳分析白 刺鹽脅迫蛋白，發(fā)現(xiàn)某些特異性表達(dá)蛋白在 其他耐鹽植物的研究中沒有被 發(fā)現(xiàn)，部分證明了可能存在不同于其他植物耐鹽性的機(jī)理，因此對(duì)鹽堿均有較高的耐受性 【 29】 。而基于白刺特有的耐鹽堿抗旱能力，受到鹽、堿、旱的三重脅迫，其基因和蛋白水平的表現(xiàn)必定與目前研究的植物耐鹽機(jī)理存在較大差異。 本研究的目的及意義 白 刺屬（ Nitraria L.）是蒺藜科 (Zygophyllaceae)的古老小屬，中國(guó)有 8 種，內(nèi)蒙古有 4 種 .該屬植物是我國(guó)內(nèi)蒙古、 甘肅和新疆一帶荒漠植被的重要建群種之一，為耐干旱、耐鹽堿、抗風(fēng)蝕沙埋、生長(zhǎng)快、易繁殖的優(yōu)良防風(fēng)固沙先鋒植物。 目前在GenBank 上登錄的 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 核酸序列達(dá)到 500 多個(gè)。 自 1976 年分別首次在動(dòng)物老鼠腎細(xì)胞質(zhì)膜上和植物大麥質(zhì)膜上發(fā)現(xiàn) Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。 Sottosanto 等通過 TDNA 插入突變體 NHX1 植株和分析 atnhx1 缺失突變體 DNA 芯片，發(fā)現(xiàn) 在對(duì)照及 100mM NaCl 鹽脅迫的土壤條件下，探討成熟植物缺失 AtNHX1 基因?qū)ζ渌D(zhuǎn) 錄本的影響，發(fā)現(xiàn) nhx1 均影響了轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，而在 100mM NaCl 脅迫下基因的變化更大 ；其次，在離子動(dòng)態(tài)平衡方面，細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸，蛋白質(zhì)定位以及其它細(xì)胞過程中發(fā)揮作用 【 21】 。這些結(jié)果顯示擬南芥液泡膜焦磷酸酶 (H+PPase)AVP1 的過量表達(dá)，明顯增加了轉(zhuǎn)基因植株跨液泡膜質(zhì)子梯度，促進(jìn)了 AtNHX1介導(dǎo)的活性，將 Na+更多的區(qū)隔化至液泡。這些結(jié)果表明，提高液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄水平，能使小麥的耐鹽性及在鹽土壤中谷粒的產(chǎn)量提高。Xue 等 【 19】 在小麥中過量表達(dá) AtNHX1，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小麥在鹽土壤中谷粒產(chǎn)量提高，并且谷粒大而重。在根細(xì)胞的液泡中積累了更多的 Na+，歸 因于 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的增強(qiáng)。 Apse 等認(rèn)為耐鹽性的提高與 ANHX1 的高水平轉(zhuǎn)錄，翻譯及 Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)體活性有關(guān) 【 17】 。而Gaxiola 等 【 16】 將 AtNHX1 在對(duì) NaCl 敏感的酵母 nhx1 突變體菌株中進(jìn)行異源表達(dá)，結(jié)果表明 AtNHX1 能抑制 nhx1 突變體的敏感表型， AtNHX1 的某些功能和酵母NHX1 是等價(jià)的， AtNHX1 恢復(fù)酵母 nhx1 突變體 Na+耐性的功能與酵母內(nèi)源的ScNHX1 功能相似。 Hamada 等 【 15】 從鹽生植物 濱藜 中克隆出 Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，命名 AgNHX1。 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能研究 目前在這方面的研究主要從以下幾方面展開：一是 NHX1 基因表達(dá)可部分恢復(fù)酵母 nhx1 突變表型 ， Xia 等 【 14】 利用RTPCR從甜菜 Beta vulgaris NHX1 同源的 BvNHX1 基因。這些結(jié)果表明，鹽脅迫下在轉(zhuǎn)錄水平上 AtNHX1 表達(dá)的增強(qiáng)，部分地依賴于 ABA 的生物合成和 ABA 通過 ABI1發(fā)出的信號(hào)。 NaCl 對(duì) AtNHX1 的上調(diào)程度在 abi11(ABA 不敏感突變體 )、 aba21 和 aba31(ABA 缺乏突變體 )中被減少，但在突變體 abi2 sos1(質(zhì)膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 SOS1 突變體 )、 sos2(蛋白激酶基因 SOS2 突變體 )和sos3(鈣結(jié)合蛋白基因 SOS3 突變體 )并無類似情況發(fā)生。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥 AtNHX1 啟動(dòng)子 GUS的分析結(jié)果 啟動(dòng)子區(qū)包含推測(cè)的 ABA 反應(yīng)元件 (ABRE)，位于起始密碼的736728 之間， ABRE 元件存在于不同物種對(duì) ABA 應(yīng)答的基因中。 關(guān)于 C 末端的作用以及調(diào)控機(jī)制，還有待于人們更進(jìn)一步的研究。 說明 AtNHX1 的 C 末端對(duì) Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性及底物選擇性具有調(diào)控作用。利用酵母異源表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行末端缺失實(shí)驗(yàn)中， N 末端缺失 17 個(gè)氨基酸引起 Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)活性輕微降低和 K+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)活性的少量增加。；二是 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 的 C 末端 對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)活性和離子選擇性的調(diào)控， 植物液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的 C 末端比質(zhì)膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的 C 末端短得多，僅有 100 多個(gè)氨基酸。 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物耐鹽性的表現(xiàn) NHX1 基因在植物耐鹽性的作用主要表現(xiàn)在以下三方面：一是 利用液泡膜 H+ATPase和液泡膜 H+PPiase產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子梯度將胞質(zhì)中的 Na+逆濃度梯度運(yùn)入液泡中 【 5】 ，這樣降低了胞質(zhì)內(nèi)的 Na+含量，維持胞質(zhì)正常的 K+/Na+比值 ,而且可以有效利用儲(chǔ)存在液泡中的Na+作為滲透劑 ,降低 Na+對(duì)植物細(xì)胞的毒害作用 【 11】 。 Yamaguchi 等 【 10】 進(jìn)一步分析了位于 液泡腔內(nèi)C 末端， AtCaM15(類似鈣調(diào)素的蛋白 )位于 C 末端 ， 依賴于 Ca2+和 pH 值 ， 調(diào)控Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物 的 選擇性， 以及 液泡中的 pH 值調(diào)控 Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與陽(yáng)離子親和性 。另外， AtNHX1 的 TM3 與 TM TM6可能分別構(gòu)成了胞質(zhì)和液泡中結(jié)合離子的結(jié)構(gòu)，它們的方向決定離子運(yùn)動(dòng)的方向 。 AtNHX1 的 TM3 區(qū)具有一個(gè)推測(cè)的氨氯吡嗪脒結(jié)合序列(FFIYLLPPI)，這段序列在其他植物 NHX 以及哺乳動(dòng)物 NHE 中均高度保守，氨氯吡嗪脒與真核生物 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合后能抑制其轉(zhuǎn)運(yùn)活性。他們的結(jié)果還表明， AtNHX1 的 N 末端朝向胞質(zhì)，但幾乎整個(gè) C 末端都位于液泡腔中。 Yamaguchi等 【 8】 分析了 AtNHX1 的膜拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn) AtNHX1 蛋白的整個(gè)結(jié)構(gòu)不 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) 同于 人的 Na+/H+交換蛋白 NHE1 和任何已知的其他 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。前者對(duì)氨氯吡嗪脒（ amiloride）及其衍生物敏感，是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)的區(qū)域，由 912 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成。這六個(gè)成員具有器官和鹽處理特異性的表達(dá)模式。擬南芥和水稻的 I 類組成員顯示出%的相似性，而 II 類成員的相似性為 %，但是與 I 類的相似性只有21%23%【 5】 。擬南芥有 6 個(gè) NHX 基因（ AtNHX），水稻有 5 個(gè) NHX 基因（ OsNHX）。相對(duì)而言， II 類的成員存在于植物內(nèi)膜囊泡上，同時(shí)也包括定位于動(dòng)物和細(xì)菌中多種內(nèi)體上的同源蛋白。 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 （ NHX） 研究進(jìn)展 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子特征 植物胞內(nèi) NHX 家族 分為兩類，分別用符號(hào) I 和 II 表示。三是滲透調(diào)節(jié)作用，一些鹽生植物依靠從外界吸收和積累無機(jī)鹽離子，進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)防止鹽害，或者在細(xì)胞中合成大 量不同有機(jī)物以降低細(xì)胞的滲透勢(shì)。二是鹽分的區(qū)隔化，主要由液泡膜上質(zhì)子泵、 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體（ NHX）和離子通道所調(diào)控。 植物的耐鹽機(jī)制 不同植物對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)方式不同，或者通過減少鹽分在體內(nèi)的積累逃避鹽害，或者通過自身生理或代謝過程來適應(yīng)或忍受細(xì)胞內(nèi)的高鹽環(huán)境。嚴(yán)重阻礙植物生長(zhǎng)發(fā)育，已成為鹽堿地區(qū)限制作物產(chǎn)量的主要因素 【 1】 。全世界大約有 20%的可耕土地及一半以上的水澆田受鹽漬化影響，并且這種影響日益加劇。 secondary salt refers to the osmotic stress by excessive soil salinity and the nutrient loss by ion petition. Since the first vacuolar Na+/H+ antiporter gene, referred to as NHX, was cloned from Arabidopsis, more than 500 of NHX orthologs were isolated. Previous research indicated that overexpression of NHX gene can enhance salttolerance ability of plants. In the study, we isolated a cDNA fragment of NHX homology from N. sibirica Pall using RTPCR, RACE and iPCR, and analyzed its gene structure and phylogeic relationship. The results will prove an important experimental basis for analyzing the expression pattern and molecular mechanism of NHX gene, and for improving saltresistant ability of glycophytes through geic transformation with NHX genes of Nitraria L. On the other hand, we isolated a cDNA fragment of actin gene from N. sibirica Pall. The expression of actin genes are stable in each ans, therefore, it was used as an internal standard for analyzing gene expression. The 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) experimental result could prove useful for geneexpression analysis of Nitraria plants. Keyword : Nitraria L.， salttolerance， Na+/H+ antiporter， RTPCR 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) 目錄 1 緒論 .............................................................................................................................7 鹽脅迫對(duì)植物的影響及植物耐鹽機(jī)制 ............................................................7 鹽脅迫對(duì)植物的傷害 ..................................................................................7 植物的耐鹽機(jī)制 ....................