【正文】 nes of Nitraria L. On the other hand, we isolated a cDNA fragment of actin gene from N. sibirica Pall. The expression of actin genes are stable in each ans, therefore, it was used as an internal standard for analyzing gene expression. The 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) experimental result could prove useful for geneexpression analysis of Nitraria plants. Keyword : Nitraria L.， salttolerance， Na+/H+ antiporter， RTPCR 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 目錄 1 緒論 .............................................................................................................................7 鹽脅迫對植物的影響及植物耐鹽機制 ............................................................7 鹽脅迫對植物的傷害 ..................................................................................7 植物的耐鹽機制 ..........................................................................................7 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白 （ NHX） 研究進展 ....................................................8 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的分子特征 ......................................................8 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白在植物耐鹽性的表現(xiàn) .......................................9 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的功 能研究 ................................................... 10 本研究的目的及意義 .......................................................................................... 12 2 材料與方法 ............................................................................................................... 13 材料 .................................................................................................................. 13 植物材料的培養(yǎng) ........................................................................................ 13 實驗試劑及配制 ....................................................................................... 13 實驗使用試劑盒 ....................................................................................... 15 實驗用引物 ............................................................................................... 15 載體及菌株 .............................................................................................. 15 主要儀器設(shè)備及其他 ................................................................................ 15 實驗方法 ........................................................................................................... 16 兼并引物設(shè)計 .......................................................................................... 16 白刺總 RNA的提取及鑒定 ....................................................................... 17 cDNA 第一鏈的合成 ................................................................................. 19 白刺 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因 cDNA片段的克隆 ..................................... 19 白刺肌動蛋白基因片段的克隆 .................................................................... 20 大腸桿菌 DH5α超級感受態(tài)細(xì)胞的制備（ TB 法） ...................................... 20 PCR產(chǎn)物的凝膠回收及 TA 克隆的與轉(zhuǎn)化 .................................................. 21 克隆基因片段序列的測定 ........................................................................... 23 白刺 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白 cDNA 3’末端的快速克隆 （ RACE） ................... 23 白刺液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因 5’末端的獲得 ................................ 25 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋 白序列分析 .................................................................. 27 3 結(jié)果與討論 ................................................................................................................ 28 實驗結(jié)果 ............................................................................................................. 28 RNA的變性瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果 ............................................................... 28 PCR產(chǎn)物鑒定 ........................................................................................... 28 白刺 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白 3’末端 cDNA 的克隆 .......................................... 29 菌落 PCR 鑒定含重組質(zhì)粒菌落 .................................................................. 29 白刺 Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白基因 5’末端的獲得 .................................................... 30 序列的 blast 比對結(jié)果 ............................................................................... 31 基因片段的 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因序列分析及系統(tǒng)樹構(gòu)建 ...................... 32 討論分析 ............................................................................................................. 33 RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳 ...................................................................... 33 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的分離 ................................................................ 33 肌動蛋白基因的內(nèi)參作用 ........................................................................... 34 4 致謝 ............................................................................................................................. 35 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 5 參考文獻 ....................................................................................................................... 36 6 附錄 ............................................................................................................................. 38 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 1 緒論 鹽脅迫對植物的影響及植物耐鹽機制 干旱半干旱地區(qū)，水分蒸發(fā)把地下鹽分帶到土壤表層，造成土壤表層鹽分過多；海濱地區(qū)海水倒流或咸水灌溉等因素，土壤表層會積累較多鹽分。植物的耐鹽機制主要包括滲透調(diào)節(jié)和降低胞內(nèi) Na+濃度。具體途徑可分為：一是減少 Na+的吸收及增加 Na+的外排，植物細(xì)胞在確 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 保其他離子吸收的條件下選擇性的排斥 Na+，不讓其通過質(zhì)膜，而高等植物的排Na+機制主要與質(zhì)膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運體（ SOS1）有關(guān)，質(zhì)膜 H+ATPase 的主要功能是驅(qū)動質(zhì)子排出質(zhì)膜，建立跨膜 pH 梯度和電勢差，即質(zhì)子驅(qū)動力，提供能量驅(qū)動膜上 Na+/H+逆向轉(zhuǎn) 運體，使質(zhì)子順電化學(xué)梯度進入細(xì)胞，同時 Na+逆化學(xué)勢排出細(xì)胞。后者大約由 300 個堿基 組成，結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有多個蛋白激酶 作 用位點，能夠與鈣調(diào)素（ calmodulin）結(jié)合，參與多種信號反應(yīng)，是調(diào)節(jié)活性的區(qū)域 【 7】 。 親水性 C 末 端 的 82 個氨基酸 缺失 使Na+/H+轉(zhuǎn)運活性大大增加，而這種缺失導(dǎo)致 K+和 H+的運輸速率相對降低， Na+和 K+的運輸比率 也是未修飾的 兩倍。二是擬南芥植物過量表達 AtNHX1 基因，轉(zhuǎn)基因植株在200mmolNaCl 的條件下生長發(fā)育良好。包括人類 Na+/H+ 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 轉(zhuǎn)運體 NHE1【 22】 、鹽生植物中間偃麥草 Elytrigia intermedia TiNHX1【 23】 、鹽地堿蓬S salsa SsNHX1【 24】 、甜土植物甜菜 BvNHX1【 14】 、經(jīng)濟作物小 麥 TaNHX1【 25】 、水稻OsNHX1【 26】 、刺槐 RpNHX1【