酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用-文庫吧資料
2025-05-18 20:49本頁面
【正文】 母中表達(dá)時發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用， 使 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。 另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助， 這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。對于認(rèn)識一些重要的生命活動：如信號傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 酵母雙雜交系統(tǒng)局限性和存在的問題 酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白 蛋白間相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的應(yīng)用， 但仍存在一些局限性?；蚪M中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。如果能找到相應(yīng)的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止 RNA病毒的復(fù)制，從而達(dá)到治療這種疾病的目的。例如： Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發(fā)現(xiàn)它的病毒 RNA復(fù)制與依賴于 RNA的 RNA聚合酶（ NS5）與拓?fù)洚悩?gòu)酶 NS3，以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)受體 BETAimportin的相互作用有關(guān)。 利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響 酵母雙雜交的報告基因能否表達(dá)在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用 利用酶聯(lián)免疫（ ELISA）、免疫共沉淀（ COIP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能 當(dāng)我們將已知基因作為誘餌，在選定的 cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到 ADLIBRARY載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的 cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究 與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系 。 ⑷ 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時期材料構(gòu)建 cDNA文庫， 能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。 ⑵ 檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行， 可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。 同時， 酵母表型， XGal及 HIS3蛋白表達(dá)等檢測方法均很敏感。 ③ 雜交蛋白間穩(wěn)定度 可被 激活結(jié)構(gòu)域 和 結(jié)合結(jié)構(gòu)域 結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物而增強(qiáng)， 后者又與 啟動子 DNA結(jié)合， 此三元復(fù)合體使其中各組分的結(jié)合趨于穩(wěn)定。主要是由于： ①采用高拷貝和強(qiáng)啟動子的表達(dá)載體使 雜合蛋白過量表達(dá) 。利用 4種報告基因 的表達(dá)，便可捕捉到新的蛋白質(zhì)。 將這兩個質(zhì)粒 共轉(zhuǎn)化 于酵母細(xì)胞中。 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立 酵母雙雜交系統(tǒng)通過兩個雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合及對報告基因的轉(zhuǎn)錄激活來捕獲新的蛋白質(zhì)，其大致步驟為 : 視 已知蛋白的 cDNA序列 為誘餌 (bait)，將其與 DNA結(jié)合域融合 ，構(gòu)建成 誘餌質(zhì)粒 。 一般編碼一個蛋白的基因融合到 明確的 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的 DNA－結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (如 GAL4bd， LexAbd)； 另一個基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 (如 GAL4ad， VP16)。 〈 2〉 具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報道基因。報道株指經(jīng)改造的、含報道基因 (reporter gene)的重組質(zhì)粒 的宿主細(xì)胞。 常用的 activatingdomain基因有： GAL4(768881)和皰疹病毒 VP16的編碼序列等。因此， 在 GAL4ad氨基端或羧基端應(yīng)克隆來自 SV40的 T抗原的一段序列作為核定位的序列。融合基因在報告株中表達(dá)， 其表達(dá)產(chǎn)物只有 定位于核內(nèi) 才能驅(qū)動報告基因的轉(zhuǎn)錄。 主要有二類載體 : a 含 DNA binding domain的載體； b 含 DNAactivating domain的載體。） 3）當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式
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