【正文】 采用酶作為標記物，通過 顯色強度反映待測物質(zhì)的濃度，由于許多因素影響酶和底物的活性，因而試劑的穩(wěn)定性、靈敏度略顯不足。 試劑穩(wěn)定性好，有效期長。電化學發(fā)光采用磁性微珠包被技術，由于磁珠體積小，可以吸附更多的抗原或抗體，同時磁珠的核心是鐵，在磁場中很快下沉，因此容易進行洗滌和固相載體分離。磁性微珠包被技術的應用提高了檢測的靈敏度。見表 討 論： 電化學發(fā)光免疫法檢測結(jié)果的穩(wěn)定性、靈敏度、精密度均優(yōu)于酶聯(lián)免疫法。 回收率：用電化學發(fā)光法與酶聯(lián)法測得平均回收率 。 結(jié) 果： 線性：電化學發(fā)光法在 ，酶聯(lián)法在，可見電化學發(fā)光法檢測范圍更寬，更能充分滿足臨床要求。 儀器與試劑：全自動酶免疫分析系統(tǒng) ES300 和全自動電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)Elecsys2020 及其配套試劑，質(zhì)控品，羅氏公司提供。為進一步了解電化學發(fā)光免疫法的特點，本文應用電化學發(fā)光免疫法與酶聯(lián)免疫法對比檢測 165 份臨床血清標本的 AFP含量， 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和比較。 （摘自《臨床薈萃》 2020年第 15卷第 15期） ２１ 電化學發(fā)光與酶聯(lián)免疫檢測血清甲胎蛋白的比較 梁崴 背景介紹：目前，臨床實驗室常規(guī)檢測血清甲胎蛋白（ AFP）多采用酶聯(lián)免疫法。在本報道所列舉的6例血清中 ,有 3例 HBeAg假陽性 ,而另 2例 HBsAg假陰性 ,說明體內(nèi)仍有 HBV復制。在全國各大小醫(yī)院里 ,ELISA法以其經(jīng)濟、簡便、易于開展和掌握已成為確診乙型肝炎最直接的實驗診斷方法 ,其結(jié)果具有相當?shù)目尚判浴? 討論 ： 乙型肝 炎是危害人類健康最嚴重的傳染病之一 ,而我國乙肝患者眾多 ,預防和治療負擔都很重 ,怎樣才能盡早盡快地發(fā)現(xiàn) HBV感染或攜帶者 ,是廣大臨床實驗工作者應予關心的問題?？赡苁俏覀兊臉吮玖可俚木壒?。由于包被試劑的純度及工藝流程等的影響 ,試劑盒本身允許有一定的假陽性 (1%～ 2%)存在 ,導致實驗有誤差。 HBsAg主要以小球形顆粒存在 ,HBeAg僅存在于 Dane顆粒上 ,在 HBsAg消失與 HBsAb出現(xiàn)后 ,仍有部分 HBV遺留在血液中 ,其 Dane顆粒表面的 HBsAg被抗體包 裹 ,故檢測結(jié)果陰性。在正常狀況下 ,HBeAg的產(chǎn)生晚于 HBsAg而消失較早。由于實驗條件限制 ,此點我們未加以驗證。經(jīng)檢測 ,在這 6例血清中 ,有 2例 RF陽性。 血清中類風濕因子 (RF)干擾。 分析： 筆者通過查閱文獻 ,及時對 6例患者的臨床資料綜合分析 ,認為以下因素可能是導致這一現(xiàn)象的主要原因 : 檢測方法不夠靈敏 ,HBV的檢測方法眾多 ,而近年來的臨床實驗室較普遍地采用 ELISA法 ,該方法要求血清中必須含一定量的 病毒顆粒 ,才可能顯示陽性結(jié)果 ,其靈敏度與 RIA相比 ,僅是 1/20,而現(xiàn)代發(fā)展起來的分子生物學方法 ,對病毒的敏感性更是提高了數(shù)百倍。 HBeAg單獨陽性表示病毒仍在體內(nèi)復制 。 HBeAg陽性的臨床意義： 作為急性乙型肝炎輔助診斷和預防的重要指標 。 試劑及方法試劑盒均由上?？迫A公司提供 (ELISA),嚴格按說明書操作。而我們在用 ELISA法檢測 HBV五項血清學標記物時 ,發(fā)現(xiàn) 6例 HBsAg陰性而 HBeAg陽性的血清。 三、結(jié)果： HBsAg：凍融前、凍融 6次后均陽性 61份，均陰性 115份，凍融前陰性凍融 6次后陽性者 1份，凍融前陽性凍融 6次后陰性者 6份，符合率為 % 抗 HBs：凍融前和凍融 6次后均 陽性 97份，均陰性 10份，凍融前陰性凍融 6次后陽性者 2份，凍融前陽性凍融 6次后陰性者 10份，符合率為 % 四、討論： 血清反復凍融對 HBsAg的檢測沒有影響，凍融 3次和凍融 6次與凍融前相比，無論陽性率和 S/N值均無明顯差別 抗 HBs凍融 3次與凍融前沒有顯著差別，而凍融 6次后與凍融前相比，其陽性率有明顯下降，經(jīng)對凍融前和凍融 6次后抗 HBs檢測相關性進行分析，發(fā)現(xiàn)凍融 6次后和凍融前無相關性，凍融前陽性標本 107份，而凍融 6次后下降至 99份，說明凍融對血清抗 HBs的檢測結(jié)果確有 影響， 原因尚不清楚 臨床上或血清流行病學調(diào)查研究中，血清可以放置在 20℃貯存，反復凍融將不會影響HBsAg的檢測結(jié)果；而對抗 HBs的檢測，應盡量避免反復凍融，進行多指標檢測時，應提前將所有試劑盒準備好，短時間內(nèi)完成?？迫A試劑。 二、材料和方法： 材料：西京醫(yī)院門診乙肝 5項檢測血清 183份，年齡、性別、診斷不限。但該方法簡便 ,不需特殊設備 ,實驗耗時較短；成本較低 ,可有效降低患者的經(jīng)濟負擔 ,減輕肉體痛苦 ,三份不同標本用同一載體 (GIFA紙片 )一次檢測即可得出 3種肝炎病毒的感 染狀況。本實驗方法具有較高的特異性和靈敏度 ,操作簡便。 方法： 采用膠體金作為免疫示蹤物 ,標記羊抗人 IgG單克隆抗體 ,將相應的病毒抗原 HAVAg、HBcAg及 HCVAg包被在硝酸纖維素薄膜表面 ,標本中所含抗體與相應的抗原結(jié)合后 ,加入金標記抗體 ,即可在薄膜表面形成肉眼可見的紅色斑點。 結(jié)論：今后對 HIV的診斷，必須針對那些已有的或新傳播的 HIV變異株，研究確診的方法。 假如可以排除動物較后期感染慢病毒和排除不同種系在一定的時間內(nèi)交叉感染，免疫缺陷病毒與靈長目長期協(xié)同演化的設想是有意義的，除了在各猿類種系演化的假說之外，可以肯定免１７ 疫缺陷病毒也有一個長期演化過程，否則我們不可能今日在羊、馬和貓也找到免疫缺陷病毒，至于如何傳播給人類的，從譜系分析尚不能得出解釋。 SIV與中非非洲大陸相關，假如考慮到各種猿類很少見或者完全不出現(xiàn)免疫缺陷病毒感染，是因為對逆轉(zhuǎn)錄病毒適應的結(jié)果，這將是一有力的證據(jù)。迄今僅在黑猩猩中發(fā)現(xiàn)一種免疫缺陷病毒，而亞洲猿猴、馬來猩猩、長臂猿和獼猴則無，經(jīng)對大猩猩調(diào)查，也末得出有免疫缺陷病毒感染 的最后結(jié)論。如將猿猴病毒與人類的病毒相比較， H1V— l與 SIV— 1有很大的相似性， SIV— l似乎是H1V— l和 HIVO之間最早的聯(lián)親。目前所建立的試驗，用引物可識別 HIV— 1的 A至 F亞型，有時也可顯示與 HIV— 2核酸的共同反應性，一般 HIV— O核酸不能用 PCR法檢出，因此， PCR對 HIV— O不能識別，反之，如用特異性引物，可特異的擴增出 HIVO核酸片段，作出診斷，作 HIV— O PCR推薦選用 Cam5和 Cam3引物，可取得很好的結(jié)果。 免疫熒光 按病毒和 HIV在細胞中濃度的不同， HIV抗原和抗 HIV— O之間有較好的交叉反應，用 HIV— 1感染的細胞作免疫熒光， H1V— O抗體滴度低時，應倍加小心判斷結(jié)果。抗 HIV— O與 B亞型的反應性有的極差，可用二種方法，１６ 一是再與 HIV— O作免疫印跡試驗，其 優(yōu)點是抗原具有同一性。競爭 ELISA顯示高度特異性，抗 HIV— O用此試劑僅儉出臨界值，或不能檢出，這種試劑識別抗 HIV— O的缺點，正如在 HIV— 2出現(xiàn)的問題，可通過加入 HIVO抗原而被排除。對診斷更為重要的是那些未識別出來的含抗 HIV— O血清，按抗原夾心法建立起的試劑，對抗 HIV— O識別 甚差，原則上必須有兩個位點，才能顯示所要求的反應性。 比較各 HIV變異株的外殼蛋白， HIV— l與 HIV— 2有 60％的差異， HIV— l與 HIV— O之間約 45％， HIV— 2與 HIV— O之間約 50％的差異。當用原病毒材料制備試劑盒時，交叉反應特別高。巴黎報道的 HIV— O感染者的性伴研究表明 HIV— O與 HIV— 1的傳播感染性相似，致病機制亦無區(qū)別， HIV— O的致病性并不亞于 HIV— l. 診斷 ELISA 估計約 80％一 90％含有 HIV— O抗體血清，可用抗 HIV— l十 2ELISA試劑 檢出，反應可用 HIV— 2抗原的交叉反應解釋。在歐洲迄今很少報道 HIV— O病例，病人多與中非有關。馬拉維、肯尼亞、象牙海岸和扎伊爾的血清分析指出，這些地區(qū)的 HIV— O的流行率并不高。 流行病學：加蓬的初步血清學調(diào)查報告其流行率為 3％，喀麥隆的 HIV感染中占 5％。因此 在方法學上夾心法比間接法具有一定的優(yōu)勢。其次，間接法采用稀釋血清加樣，降低了樣品的 HTLV特異性抗體濃度，而夾心法采用原 (或半 )倍血清加樣，提高了檢出率，增大了靈敏度。這可能與試劑盒所采用的方法不同有關。結(jié)果發(fā)現(xiàn)全部試劑的敏感度均可達到 100%，但 3種間接法試劑均出現(xiàn)了多份假陽性，陽性預測值僅在 30%左右，而北京的雙抗原夾 心法試劑則未發(fā)現(xiàn)假陽性。既往國內(nèi)僅 有間接免疫熒光法（ IFA）試劑供應，該法由于操作相對復雜，尤其是結(jié)果的判斷需要昂貴的熒光顯微鏡，而且受主觀因素影響大，因此難以作為篩選試劑，而進口的 ELISA試劑或明膠微粒凝集法（ GPA）試劑價格昂貴，這也從客觀上阻礙了我國 HTLV相關研究的進行及篩檢策略的實施。 表 1 四種 ELISA試劑盒檢測抗 HTLV結(jié)果比較 北京 上海 Genelabs UBI ＋ － 合計 ＋ － 合計 ＋ － 合計 ＋ 4 0 4 4 0 4 4 0 4 １４ － 11 782 793 4 789 793 5 788 793 合計 15 782 797 8 789 797 9 788 797 24份 ELISA抗 HTLV陽性的標本經(jīng) Western blot（ WB）確證， 4份共同陽性的標本為抗 HTLVⅠ陽性，蛋白印跡帶型表現(xiàn)為： 2條 ENV帶（ GD21和 rgp462Ⅰ）及 GAG帶 (p19和 /或 p24)陽性，其它20份標本都無 HTLV特異反應帶出現(xiàn)。而北京試劑與上海、 Genelabs、 UBI三種試劑配對檢驗結(jié)果分別為：χ 2=， P﹤ ；χ 2=， P﹥ 。其中只有 4份標本四種試劑的檢測結(jié)果都為陽性，除北京試劑外，其它三種間接酶免法試劑各出現(xiàn) 4份、 5份、 11份互不相同的陽性標本。 主要儀器 美國伯樂 550酶標儀，美國寶特 Elx50洗板機。 抗體確證試驗 以 Genelabs公司的 HTLVⅠ /Ⅱ 4 種 ELISA試劑陽性血清的 Western blot（ WB）確證。 抗體篩查試劑盒 進口 HTLVⅠ /Ⅱ ELISA抗體檢測試劑盒分別為新加坡 Genelabs公司和美國 UBI公司產(chǎn)品；國產(chǎn)試劑盒 2種，為上海某廠家的 HTLV（Ⅰ +Ⅱ）抗體 ELISA試劑盒以及北京某廠家的 HTLV（Ⅰ +Ⅱ）抗體 EIA試劑盒。因此，在我國獻 血者中開展 HTLV感染的篩查已成為一個迫切需要認真考慮的問題，其中尤以篩查試劑的選擇最為重要。 （部分內(nèi)容摘自國家農(nóng)業(yè)部《 H5N1高致病性禽流感防治手冊》） 4 種 ELISA 試劑篩查獻血人群抗 HTLV 結(jié)果評價 康麗娜 人類 T淋巴細胞白血病病毒（ HTLVⅠ /Ⅱ）在全球廣泛存在，主要流行于日本西南部、加勒比海和中、南非洲、巴布亞新幾內(nèi)亞等部分地區(qū)。 解決方法：對現(xiàn)有的標記系統(tǒng)，包被系統(tǒng)以 及緩沖系統(tǒng)進行調(diào)整。我個人認為，金標法 HA檢測試劑盒更適合現(xiàn)場使用，應大力開發(fā)并各省 CDC推廣使用。 綜上述， H5禽流感病毒的檢測方法各有利弊。間接免疫熒光技術也可以用來檢測核蛋白（ NP）基質(zhì)蛋白（ MP）抗原與抗體的反應，其敏感性很高。其敏感度同病毒的分離鑒定相當，有時高于用雞胚進行的病毒分離。用于禽流感病毒的診斷常用直接熒光抗體法，即在組織切片上直接染色，以熒光顯微鏡檢查熒光，一種 AIV的熒光抗體可用來檢測不同亞型的其他病毒。1984年美國賓西法尼亞州爆發(fā)禽流感時 Skeeles將 IFT首次用于 AIV的檢測。 免疫熒光法 免疫熒光技術就是熒光抗體技術（ FAT）。 RTPCR診斷技術經(jīng)試驗表明，可應用于對所有亞型禽流感感染的早期快速診斷，具有敏感、特異、快速的特點；另外，為特異、快速地檢出可引起高致病力禽流感大爆發(fā)的 H5或 H7亞型禽流感病毒的感染，通過對比禽流感病毒血凝素基因保守序列，設計了特異性引物 ,建立了對臨床病料或雞胚接種物中 H5和 H7亞型禽流感病毒進行快速分型檢測 RTPCR診斷技術；此外， H5和 H7亞 型禽流感病毒分子分型診斷技術在特異地檢出 H5或 H7亞型禽流感病毒感染的同 時，還可根據(jù)應用特定引物經(jīng) RTPCR擴增出的 H5和 H7包括裂解位點在內(nèi)的 HA基因片段，經(jīng)測序推導出的氨基酸序列來判斷 H5或 H7亞型禽流感病毒的致１２ 病性高低，在為我國禽流感尤其是高致病力禽流感的防制提供先進、有效的早期快速診斷技術和監(jiān)測手段的同時，也為高致病力禽流感防制 爭取到極為寶貴的快速反應時間。 RTPCR檢測 近幾年發(fā)展起來的熒光定量 RTPCR分子診斷技術，配合熒光定量 PCR儀可以從基因水平檢測禽流感 RNA基因，具有高度的敏感性和特異性，并且可大大地縮短對 AI病毒的檢出時間，克服了傳統(tǒng)的禽流感診斷技術包括病毒分離鑒定試驗周期長的缺點，為禽流感早期快速診斷提供了敏感、快速、實用的檢測 方法。當標本 中不含流感病毒抗體