【正文】 ℃ )；玉米漿的比熱容為 (kg℃ )； 加熱蒸汽的冷凝水的熱焓為 kJ/(kg℃ )； 水的比熱容為 (kg 1kg/L247。400mg/L= ： 已知發(fā)酵液需求量為 玉米淀粉量： 10g/L=149182480g= 玉米漿量： 40g/L=149182480g= 棉籽油量： 50ml/L=186478100ml=186478L 磷酸二氫鉀量： 1g/L== 硫酸鎂量： VB1量： 300g/L可得： 已知發(fā)酵液需求量為 ，流加糖液量為發(fā)酵培養(yǎng)基的 10%，則 葡萄糖量： 10%300g/L= 1g/L可得： 已知發(fā)酵液需求量為 ，則 煙草廢棄物量： 1g/L== 10%可得： 已知發(fā)酵液需求量為 ，則 接種量： 10%= 20ml/g菌粉可得： 干燥的菌粉約等于發(fā)酵后的番茄紅素的量，已知 發(fā)酵后的番茄紅素量 ，則石油醚的量： 10320ml/g菌粉 =29836400mL= TBHQ5%可得： 蘭州交通大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 15 已知萃取劑用量 ，則 TBHQ量： 5%= ，甲醇溶液為 80%的水溶液其配比為 400g/L，可得：干燥的菌粉約等于發(fā)酵后的番茄紅素的量，已知 發(fā)酵后的番茄紅素量，則：氫氧化鉀的量： 103 甲醇水溶液的量： 149182g247。75%247。95%247。75%247。95%247。98%247。98%= 80%可得：萃取后的番茄紅素量： 1000kg247。90%= 精制階段的收率 98%可得：皂化后番茄紅素量： 1000kg247。 蘭州交通大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 14 ⑥操作參數(shù)：發(fā)酵周期 120 h，發(fā)酵溫度 28℃，攪拌速速 250r/min。 4 工藝計(jì)算 物料衡算 工藝技術(shù)指標(biāo)及基礎(chǔ)數(shù)據(jù) ①生產(chǎn)規(guī)模：年產(chǎn)量 15 t； ②生產(chǎn)天數(shù)：除去節(jié)假日，機(jī)器維修時(shí)間，每年按工作 250 天計(jì)算； ③日生產(chǎn)量： 15247。但在發(fā)酵 60 h 后添加阻斷劑，阻斷效果就明顯低于 48 h。 阻斷劑最佳添加時(shí)間的確立 我們選擇吡啶作為阻斷劑。一方面是菌體的生長(zhǎng)指標(biāo)，即菌體干重；另一方面則是菌體的代謝指標(biāo)，即β－胡蘿卜素的產(chǎn)在發(fā)酵前 48 h，細(xì)胞合成β－胡蘿卜素的酶系還為完全建立，β－胡蘿卜素含量較低；而在 48 h 以后，菌體開(kāi)始大量合成β－胡蘿卜素，在 120 h 達(dá)到最大，此時(shí)，菌體干重雖然開(kāi)始下降，但單位發(fā)酵液中β－胡蘿卜素 含量仍然保持較高的水平。不過(guò)，一般都以提高生產(chǎn)率為首要的目標(biāo)。這可能是由于接種量較高時(shí)，菌體生長(zhǎng)迅速，很快 耗盡了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給菌體生長(zhǎng)，而沒(méi)有被利用來(lái)合成目標(biāo)產(chǎn)物。大量的體外水解酶類，有利于基質(zhì)蘭州交通大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 13 的利用。采用較大的接種量可以縮短菌絲體達(dá)到高峰的時(shí)間，使得產(chǎn)物提早形成。而裝液量太大時(shí)，細(xì)胞攝氧率下降，菌體生長(zhǎng)代謝也受到抑制 。因而，我們選擇轉(zhuǎn)速為 250轉(zhuǎn) /分。隨著轉(zhuǎn)速的提高，菌體中β－胡蘿卜素的含量增加，這說(shuō)明三孢布拉氏霉菌對(duì)氧的需求量是很大的。在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中，可以通過(guò)轉(zhuǎn)速和裝液量來(lái)考察溶氧對(duì)發(fā)酵的影響。另外，發(fā)酵后期 pH 偏酸性有利于β－胡蘿卜素的合成。 pH 對(duì)發(fā)酵的影響 經(jīng)過(guò)考察發(fā)酵液起的 pH 從 變化到 對(duì)發(fā)酵的影響。因而，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們就控制溫度變化范圍為177。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)三孢布拉氏霉菌生物量最高的培養(yǎng)溫度是 26℃，但在此時(shí)，細(xì)胞生產(chǎn)β－胡蘿卜素的能力并沒(méi)有達(dá)到最大；而在 28℃時(shí)，細(xì)胞合成β－胡蘿卜素的能力達(dá)到最佳；但再隨著溫度的升高，菌體合成β－胡蘿卜素的能力開(kāi)始下降。對(duì)同一微生物來(lái)說(shuō)，其不同的生理生化過(guò)程有著不同的最適溫度。 斜面培養(yǎng) 種子培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng) 過(guò)濾 真空干燥 細(xì)胞破碎 石油醚 萃取 皂化 真空濃縮 低溫結(jié)晶 洗滌干燥晶體 油樹(shù)脂保存 蘭州交通大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 12 （ 12）保存：由于番茄紅素不 穩(wěn)定，需低溫避光保存，選用石油醚來(lái)保存。 （ 10）低溫結(jié)晶：無(wú)水乙醇的用量為濃縮液體積的 10 倍，溫度控制在 0℃ 5℃，結(jié)晶 12h。 （ 8）皂化：溫度控制在 50℃ 60℃之間，皂化時(shí)間為 30 min。 （ 6）細(xì)胞破碎：將干菌體細(xì)胞 研磨破碎，粉碎成 6080 目的菌粉。 （ 4）過(guò)濾：將發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾，將菌體和發(fā)酵液分開(kāi)而得到深紅色濕菌體。 （ 3）發(fā)酵：將培養(yǎng)良好的（ +）、（ ）菌孢子懸浮液在無(wú)菌條件下按 1:10的體積比混合制成種子液，在無(wú)菌條件下接入種子液，在 28℃ 條件下進(jìn)行發(fā)酵。 蘭州交通大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 11 工藝流程 28 h 48 h 流加糖 正負(fù)菌混合 60 h 添加阻斷 工藝說(shuō)明 （ 1） PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種：將三孢布拉氏霉菌（ +）、（ ）原菌經(jīng)活化后，分別接種于斜面培養(yǎng)基上，在 28℃ 條件下，培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h。無(wú)水乙醇的用量為濃縮液的 10 倍時(shí)利于結(jié)晶，溫度控制在0℃ 5℃，結(jié)晶時(shí)間 12 h；精制階段的收率為 98%。 精制階段 皂化后，將下相水相處理后溶劑回收利用。皂化時(shí)，溫度控制在 50℃60℃之間，皂化時(shí)間為 30 min。 萃取過(guò)程中番茄紅素的損失主要在于番茄紅素的降解，因而在萃取過(guò)程中添加抗氧化劑 TBHQ（叔丁基對(duì)苯二酚，是一種安全食品添加劑），可使萃取率提高近 20%，而且萃取損失率只有 5%左右。萃取溫度為 60℃ 70℃之間，萃取劑用量 20 ml/g,添加 5%抗氧化劑 TBHQ，萃取直至無(wú)色為止。再將菌體經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎儀粉碎成菌粉。 流加工藝的確定 在發(fā)酵時(shí)，按一定的時(shí)間一定的速度流加糖液，且在發(fā)酵 60 h 時(shí)，添加阻斷劑采用正交實(shí)驗(yàn)的方法分別考察糖液流加起始時(shí)間流加糖量發(fā)酵時(shí)間 對(duì)發(fā)酵生物量以及番茄紅素含量的影響，并利用正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果優(yōu)化流加條件 [21]。 發(fā)酵后期發(fā)酵液處理方法 分離純化工藝一般包括：培養(yǎng)液的預(yù)處理和固液分離；初步提??；高度純化和成品加工四個(gè)部分。 設(shè)計(jì)步驟 孢子懸浮液制備 將三孢布拉氏霉菌（ +）（ ）原菌經(jīng)活化后，分別接種于 PDA 斜面培養(yǎng)基上，在 28℃條件下，培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h，然后在有氧有光的環(huán)境中，于 18℃再繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，可得生長(zhǎng)良好的（ +）（ ）菌孢子，分別挑取（ +）（ ）的孢子囊接入已滅菌的生理鹽水中，并用磁力攪拌器攪拌，制得孢子懸浮液。 蘭州交通大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 9 流加糖液 淀粉經(jīng)糖化后，制成 300 g/L 的葡萄糖液，滅菌后備用 [20]。 培養(yǎng)基的選擇 PDA 培養(yǎng)基 葡萄糖 g/L 、玉米漿 g/L、 g/L、 g/L、 VB 少許， 種子培養(yǎng)基 淀粉 40 g/L、玉米漿 40 g/L、葡萄糖 25 g/L、 KH2PO4 g/L、 g/L、 VB少許， 初始。誘變菌種的生產(chǎn)性狀不穩(wěn)定，導(dǎo)致番茄紅素的 產(chǎn)量低，而基因工程技術(shù)雖可以從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模走向小規(guī)模產(chǎn)業(yè)化，但由于工程細(xì)胞所攜帶的質(zhì)粒對(duì)于過(guò)程控制條件要求苛刻，那么在中試規(guī)模甚至大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中，其所攜帶的質(zhì)粒容易脫落，從而導(dǎo)致產(chǎn)量大幅降低，是嚴(yán)重制約番茄紅素工程生產(chǎn)菌種走向產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。菌種選育通常采用誘變育種的方法， Mehta 等 [19]糾采用亞硝基胍對(duì)野生三孢布拉氏霉菌 (B． trispora)：菌株 (+)F986 和菌株 (一 )F921 進(jìn)行突變改良，獲得兩性突變體菌株，番茄紅素的含量為 15 ms/s，較出發(fā)菌株提高了 倍。生產(chǎn)出來(lái)的番茄紅素純度高，可以用于醫(yī)藥、保健等一些關(guān)鍵領(lǐng)域。如何選育產(chǎn)量高、遺傳穩(wěn)定性好的番茄紅素生產(chǎn)菌株及優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)工藝仍是現(xiàn)在研究的重點(diǎn)。從發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，微 生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素有極大的蘭州交通大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 8 市場(chǎng)和工業(yè)化潛力，是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)較理想的一條途徑。采用發(fā)酵法能降低成本，污染相對(duì)較小，利用傳統(tǒng)的突變技術(shù)或應(yīng)用分子生物學(xué)的技術(shù)可得到產(chǎn)番茄紅素的高產(chǎn)菌株。 我國(guó)對(duì)番茄紅素的研究現(xiàn)狀 我國(guó)對(duì)番茄紅素的研究在 20xx 年以前鮮有報(bào)道，近 3 年驟然升溫，出現(xiàn)了大量綜述類文章，內(nèi)容包括番茄紅素的性 質(zhì)和提取方法，番茄紅素保健功能的研究現(xiàn)狀，番茄紅素及其生產(chǎn)應(yīng)用研究，番茄紅素的生產(chǎn)工藝研究進(jìn)展，番茄紅素分離與分析的研究進(jìn)展等 [18]。 國(guó)外對(duì)番茄紅素的研究現(xiàn)狀 1989 年， Mascio 發(fā)現(xiàn)番茄紅素在所有類胡蘿卜素中對(duì)單線態(tài)氧的猝滅速度最高。 國(guó)內(nèi)外對(duì)番茄紅素的研究進(jìn)展 1873 年， Hartsen[15]最早從 Tamus 1875 年， Millardet[16]從番茄中獲得一種含有番茄紅素的粗提物，當(dāng)時(shí)命名為 Solanorubin. Schunck（ 1930 年）命名的“ lycopene”名稱（中文即番茄紅素）一直沿用至今。日本 Kirin Brewerr蘭州交通大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 7 公司采用代謝工程技術(shù)，即通過(guò) DNA 重組技術(shù)改變細(xì)胞的代謝系統(tǒng)芻三產(chǎn)番茄紅素Kajiwara 等從產(chǎn)生蝦黃素的酵母 Pharffi arhosozyma 和雨生紅球藻中分離出 cDNA 編碼異戊烯焦磷酸酯 (Ipp)異構(gòu)酶，將編碼 IPP 異構(gòu)酶 cDNA 轉(zhuǎn)入 E． coli 菌株 JmL01 能增加番茄紅素的產(chǎn)量 ～ 倍。此外，三孢布拉霉菌株具有獨(dú)特的代謝過(guò)程，添加植物油，表面活性劑，抗氧化劑和各種結(jié)構(gòu)類似物能提高 8一胡蘿卜素的產(chǎn)量，但如果添加其他的發(fā)酵促進(jìn)劑可有助于其他類胡蘿卜素的產(chǎn)量，如通過(guò)改變以 8 一胡蘿 b 素為主的三孢布拉霉菌的生長(zhǎng)條件和添加助劑 (Na2CO呱啶等 )，可阻斷該菌 8 一胡蘿卜素生物合成途徑中最后的二步環(huán)化反應(yīng)，從而使番茄紅素積累。另有資料表明：添加煙草的廢棄物于霉菌的發(fā)酵液中，經(jīng) 110 h 發(fā)酵，可得到番茄紅素約 6080 mg/100 mL。目前含番茄紅素較高的有紅色細(xì)菌，但還未能工業(yè)化生產(chǎn)。 微生物發(fā)酵法 除了 從含有番茄紅素的物質(zhì)中提取或用化學(xué)合成番茄紅素外，還可以采用藻類和真菌及酵母發(fā)酵 [14]生產(chǎn)番茄紅素。 酶反應(yīng)法 將番茄皮渣加堿調(diào)至 ～ 使番茄皮中的果膠酶和纖維素酶反應(yīng)，分解果膠和纖維素 ，使得番茄紅素的蛋白質(zhì)復(fù)合物從細(xì)胞中溶出，然后于 4560℃下加熱攪拌 5 h左右，過(guò)濾，加酸調(diào)整濾液至弱酸性 ()，使類胡蘿卜素聚沉，靜止后吸去上清液，得含番茄紅素的沉淀，調(diào)整沉淀物的 pH 之后真空濃縮，然后加酸或食鹽保存等通過(guò)外加果膠酶和纖維素酶的方法來(lái)提取番茄紅素。另?yè)?jù)資料報(bào)道，以乙酸松油酯為原料，經(jīng)過(guò)系列化學(xué)反應(yīng)，合成番茄紅素的代謝五： 2,6環(huán)番茄紅素 1,5二醇和 5,6二羥基 5,6氫番茄紅素。到現(xiàn)在，能用化學(xué)法合成的類胡蘿卜素已很多?？梢哉f(shuō)，微波提取在天然色素的提取工藝中具有廣闊的應(yīng)用前景。與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法相比微波提取最大的優(yōu)點(diǎn)是提取時(shí)間大大縮短，且提取率較高。 微波輻射法 番茄紅素是脂溶性色素，而脂溶性色素的提取特點(diǎn)是提取時(shí)間較長(zhǎng)，原因是有機(jī)溶劑不易滲透穿過(guò)物質(zhì)的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，所以不能很好的將提取物從細(xì)胞器中溶出。安本光政等研究了超臨界 CO 從番茄皮中提取番茄紅素，原料微粉碎或經(jīng)果膠酶，纖維素酶處理后，提取壓力 270 kg／ cm，提取溫度 40℃，提取率達(dá) 95%。但通過(guò)此法獲 得的產(chǎn)品質(zhì)量差，純度低，有異味和溶劑殘留，嚴(yán)重影響了天然色素的推廣。歐洲一專利采用 95%的乙醇作溶劑，逆流法 78℃浸提 5 h，獲得色素液，真空濃縮除去溶劑后得粉狀色素產(chǎn)品。利用這一特性， 一般選用親油性有機(jī)溶劑提取番茄紅素工藝為： 蘭州交通大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 5 濾渣 — 二次浸提 番茄皮 — 干燥 — 有機(jī)溶劑浸提 — 提取液 — 過(guò)濾 — 濾液 提取液 — 色素 — 包裝 選用此法提取番茄皮中的色素，采用石油醚室溫浸泡 l0～ 24 h。近年來(lái)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，酶反應(yīng)法和超臨界流體萃取等方法也被用于番茄皮中番茄紅素的提取，此外，微生物發(fā)酵法作為一種新型的方法將是未來(lái)發(fā)展的方向 [9]。番茄紅素在番茄皮的下表皮細(xì)胞中含量較高，一般在 l0～ 15 mg/100 g，因此，可利用番茄皮提取番茄紅素。 番茄紅素 的提取原理 由于合成色素一般都有毒性和致癌性，對(duì)人類造成極大的危害，從整個(gè)食用色素的發(fā)展情況來(lái)看，在世界范圍內(nèi)，合成色素有被淘汰的可能性，從而勢(shì)必造成天然食用色素成為唯一的使用色素。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可影響乳腺、肺和子宮癌細(xì)胞周期的 S 階段；番茄紅素通過(guò)抑制細(xì)胞周期中 Gl到 S 的轉(zhuǎn)化階段來(lái)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)；番茄紅素通過(guò)可抑制 LDL膽固醇的氧化和煎烤肉、魚(yú)的褐色反應(yīng)中產(chǎn)生的雜環(huán)胺類的形成，從而有效地抑制致癌物的產(chǎn)生及誘發(fā)腫瘤。 番茄紅素的保健作用 番茄紅素