【正文】 目前常用的人造染色體載體包括： 細(xì)菌人造染色體（ BAC） 酵母人造染色體（ YAC） 人造染色體載體 細(xì)菌人造染色體（ Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子 F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上 構(gòu)建的，其裝載量范圍在 50 300 kb之間 各種類型的 pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝 pBACs主要適用于： 克隆大型基因簇（ gene cluster） 結(jié)構(gòu) 構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫 人造染色體載體 酵母人造染色體（ Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC載體應(yīng)含有下列元件： 酵母染色體的端粒序列 酵母人造染色體的構(gòu)建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色體的復(fù)制子 酵母染色體的中心粒序列 酵母系統(tǒng)的 選擇標(biāo)記 大腸桿菌的復(fù)制子 大腸桿菌的 選擇標(biāo)記 YAC載體的裝載量為 350 400 kb 人造染色體載體 酵母人造染色體（ Yeast Artificial Chromosomes YAC） 酵母人造染色體的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 連接 轉(zhuǎn)化酵母菌 重組酵母染色體 C 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞 3 基因工程的基本條件 各種基因工程受體的特性 實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 限制性缺陷型 外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（ recB， recC， hsdR） 重組整合缺陷型 用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞 （ recA） 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型 感染寄生缺陷型 防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染，生物武器除外 各種基因工程受體的特性 大腸桿菌 遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長迅速，培養(yǎng)簡單，重組子穩(wěn)定 適用于外源 DNA的擴(kuò)增和克隆、原核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建，是 DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要受體菌 產(chǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素 各種基因工程受體的特性 枯草桿菌 遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全 ，生長迅速，培養(yǎng)簡單，不產(chǎn)內(nèi)毒素 適用于原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌 遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備 各種基因工程受體的特性 鏈霉菌 抗生素的主要生產(chǎn)者，分子遺傳相對(duì)操作簡便，不產(chǎn)內(nèi)毒素 主要用于抗生素生產(chǎn)菌株的改良 遺傳不穩(wěn)定，生長相對(duì)緩慢 各種基因工程受體的特性 酵母菌 具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定 適用于外源 DNA的擴(kuò)增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的研究，是 DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程重要的真核性受體菌 內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高 各種基因工程受體的特性 昆蟲細(xì)胞（家蠶） 具有真核生物的特征，外源基因表達(dá)量高，繁殖相對(duì)較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定 適用于真核生物基因的高效表達(dá) DNA重組操作系統(tǒng)欠完善 各種基因工程受體的特性 哺乳動(dòng)物細(xì)胞（中國 倉鼠卵巢細(xì)胞 CHO） 與人的親緣關(guān)系近，分子重組表達(dá)系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng) 適用于哺乳類動(dòng)物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是 DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要哺乳動(dòng)物受體 細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長緩慢 各種基因工程受體的特性 植物細(xì)胞（擬南芥菜、煙葉 ） 農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)意義重大，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞易于分化，細(xì)胞培養(yǎng)簡單且成本低廉，具有光合作用 適用于高等植物基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因藥物的生產(chǎn)，農(nóng)作物品質(zhì)的改良 遺傳操作繁瑣 實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體 大腸桿菌 用于接受質(zhì)粒： C600、 W31 HB10 JM8 JM101（ Aps、 Tcs、 Cms） 用于接受 lDNA： LE39 ED8654 酵母菌 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 CHO 畢赤酵母 啤酒酵母 演講完畢，謝謝觀看！ 。 將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn) 定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒 和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組 DNA分子在細(xì)胞內(nèi) 不能形成噬菌體顆粒。 在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體 DNA的長度， 就能同步增加載體的裝載能力。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類： 單鏈 DNA病毒 雙鏈 DNA病毒 單鏈 RNA病毒 雙鏈 RNA病毒 RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的 DNA中間反應(yīng)物， 這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的 DNA重組。而且重組分子越大，混濁 斑的混濁度亦越大 但 M13DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有 kb 噬菌體或病毒 DNA 與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病 毒基因組 DNA。 包裝時(shí) ， 當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組 lDNA分子混合后 ， 包裝才能有效進(jìn)行 ， 任何一種蛋白包裝液被重組 lDNA污染后 ， 均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒 ， 這也是基于安全而設(shè)計(jì)的 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA及其重組分子的分離純化： 將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期 加入 l噬菌體或重組 l噬菌體的懸浮液， 37℃ 培養(yǎng) 1小時(shí) 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng) 4 12小時(shí)。若將外 源 DNA取代 red和 gam， 重組 噬菌體便擁有 Spi表型，能在 P2噬菌 體 溶源性 的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA重組分子的體外包裝： lDNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒 ， 方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞 用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了 l噬菌體的大腸桿菌中提取 ， 現(xiàn)已商品化 。 將野生型 lDNA上 D和 E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的 CAG密碼子突變成 UAG。當(dāng)外源基 因插入到 lacZ基因中，基因滅活，不能 合成藍(lán)色化合物；而空載體 lDNA則產(chǎn) 生藍(lán)色透明斑 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 構(gòu)建琥珀密碼子的突變體 琥珀型突變 （ sup)是指由 CAG（ Gln） 向 UAG（ stop） 的突變 。 根據(jù)切除的多少 ， 可將 lDNA分成兩大類載體： 插入型載體 取代型載體 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 縮短長度 插入型載體 體外包裝 插入位點(diǎn) 體外包裝 插入片段 載體長度 37 kb 插入片段大?。? 0 14 kb （ 51 – 37） 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 縮短長度 取代型載體 體外包裝 體外包裝 插入片段 最小裝載長度 10 kb （ 51 – 26） 載體長度 26 kb 插入片段 最大裝載長度 25 kb （ 36 – 26） 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn) 野生型的 lDNA鏈上有 5個(gè) EcoRI位點(diǎn)和 7個(gè) HindIII位點(diǎn)，不 利于重組操作，必須刪除至 1 2個(gè) 同時(shí)，為了便于各種來源的 DNA片段的克隆，還需要增加一 些單一的酶切位點(diǎn) 除了簡單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶 位點(diǎn) 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 加裝選擇標(biāo)記 與質(zhì)粒不同，野生型 lDNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此 加裝 選擇標(biāo)記是 lDNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容 lDNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類： 免疫功能類標(biāo)記 顏色反應(yīng)類標(biāo)記 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 加裝選擇標(biāo)記 imm434 imm434基因編碼一種阻止 l噬菌體 進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。 因此縮短野生型 lDNA的長度 ， 可以提高裝載量 。 整合主要由 lDNA上的 cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活 ， 而這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì) 。oriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396 452E co RI S st I K p n I S m a I X b a I S a lI P st I S p h I Hind III 質(zhì)粒 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 pUC18 / 19： 正選擇標(biāo)記 lacZ’ 的顯色原理 pUC18/19 Plac lacZ’ MCS b半乳糖苷酶的 a肽段 a b OHHHOHHO HH O HCH 2 OHONClBrClBr