【正文】 他發(fā)現(xiàn)當(dāng)蔗糖的濃度比酶的濃度高許多時，反應(yīng)速度不再取決于蔗糖的濃度，即是說，反應(yīng)速度相對于蔗糖來說是零級反應(yīng)。 1. 底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響 . 底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響如 圖 37所示。由于酶的最基本特性就是加快生物化學(xué)反應(yīng)速度，因此，所有酶的催化反應(yīng)速度以及它們的催化效率都是可以定量的。 酶的純度是用比活力表示的 ： 比活力 = 活力單位數(shù) /mg蛋白 = 總活力單位數(shù) /總 mg蛋白 . 例如 , 某酶經(jīng)過四個純化步驟后 , 獲得如下的數(shù)據(jù) : 純化步驟： Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 總活力： 6 4 3 2 總蛋白： 20 10 5 2 比活力： 6/20 4/10 3/5 2/2 在提純中，總活性在減少，總蛋白也在減少，但比活性在提高。 2. 酶的活力單位 . 國際酶學(xué)委員會規(guī)定 , 一個酶活力單位 (unit,u) 是指在 25℃下 , 其它條件如 pH及底物濃度均采用最適條件 , 在 1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1μ mol底物的酶量 (或轉(zhuǎn)化 1μ mol底物的有關(guān)基團的酶量 ).但是，酶的活力單位常根據(jù)實際需要來規(guī)定。 (連接酶 )類 (ligases)： 這類酶催化一切必須與 ATP分解相聯(lián)，并由二種物質(zhì)合成一種物質(zhì)的反應(yīng)： A + B + ATP → A (transferanses)： 催化功能基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng)： AB + C ←→A + BC (hydrolases): 催化水解反應(yīng) :AB + HOH →AOH + BH (lyases)： 催化底物裂解反應(yīng)，并產(chǎn)生雙鍵，或其 逆反應(yīng)，將一個基團加到雙鍵上： A2H + B → A + B 例如： L谷氨脫氫酶催化的反應(yīng)是： （圖 33） 谷氨酸： NAD+脫氫酶 (脫氨 )。例如：乙醇： NAD+脫氫酶 . 2).不管催化正反應(yīng)還是逆反應(yīng)，一般都用同一名稱。常規(guī)酶最顯著的催化效力是因為它們對所催化的反應(yīng)轉(zhuǎn)換態(tài)中間物有很高的親和力，因而抗體酶同它的專一性底物（抗原）必定有很高親和力。 推理是： 一種能專一同某反應(yīng)的轉(zhuǎn)換態(tài)中間物結(jié)合的蛋白質(zhì)，必定能啟動正常反應(yīng)物進入到活潑的轉(zhuǎn)換態(tài)構(gòu)象。催化抗體 (catalytic antibodies)又叫做抗體酶 (abzymes)。催化這一反應(yīng)的酶叫做肽基轉(zhuǎn)移酶。該過程需要鳥苷或者鳥苷酸的存在 .在體內(nèi)，這種剪接方式可能只進行一次， 但在體外， 他象一種真正的酶一樣能作用多次。， 在體外， 單獨的蛋白質(zhì)組分不能催化 tRNA前體轉(zhuǎn)變成 tRNA，而 RNA組分在適當(dāng)?shù)臈l件下能完成這種轉(zhuǎn)變反應(yīng)。這些 具有催化活性的 RNA，叫做 Ribozyme，意即酶活性 RNA。 兩者對酶活性都是必須的，前者決定酶的專一性，后者決定酶的催化能力。 、結(jié)合部位和催化部位 酶的活性中心通常是指酶分子上直接與底物結(jié)合并與催化作用直接有關(guān)的部位，是由酶分子上的某些氨基酸殘基的側(cè)鏈基團共同構(gòu)成。 五 、 酶的組成 1．酶的組成 ●由單純蛋白質(zhì)所構(gòu)成的酶 ●由蛋白質(zhì)和其他成分構(gòu)成的酶 :除了蛋白質(zhì)成分 (即 酶蛋白apoenzyme)外，還含有一些對熱穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)小分子物質(zhì) (即 輔助因子 cofactor)。 某一種酶往往只能對某一類物質(zhì)起作用，或者只對某一種物質(zhì)起催化作用。 反應(yīng)的平衡與△ G0′ （產(chǎn)物與反應(yīng)物所固有的標準自由能之差）有著密切的關(guān)系，但反應(yīng)速度則與△ G?有關(guān)。酶的存在，象其他催化劑一樣，只能降低達到轉(zhuǎn)換態(tài)所需的活化能而不能改變反應(yīng)的平衡，它唯一的作用是加速反應(yīng)物和產(chǎn)物的相互轉(zhuǎn)化。 三、酶不能改變化學(xué)反應(yīng)的平衡 反應(yīng)速度和反應(yīng)平衡之間有著重要的差別。 因此，在有催化劑存在的情況下，轉(zhuǎn)換態(tài)能比較有效地達到，從而增高反應(yīng)的速度。 毫無例外 , 每一種化學(xué)反應(yīng)都有一個 △G?。 很顯然 , 轉(zhuǎn)換態(tài)越能有效的達到，反應(yīng)的速度就越大。 反應(yīng)的發(fā)生 ,即產(chǎn)物的生成取決于過渡態(tài)或轉(zhuǎn)換態(tài) (transition state)的能量狀況 。酶的催化活性受多種因素調(diào)節(jié)控制。 練習(xí)題 1. 某種蛋白質(zhì)當(dāng)用凝膠過濾法測定其分子量為 90kD，而用SDSPAGE測定其分子量為 60kD，無論是否有巰基乙醇存在都如此。B 假若用化學(xué)的方法先將 B物質(zhì)與一種不溶性載體 (R) 偶聯(lián)，得到 RB，偶聯(lián)到 R上的 B不喪失與 A結(jié)合的能力的話，那麼，將含有 A的混合蛋白通過裝有 RB的層析柱時， A將與 B結(jié)合 , 形成 R－ B 五、蛋白質(zhì)的配體特異性與親和層析 根據(jù)蛋白質(zhì)的配體特異性，建立了一種非常有效的蛋白質(zhì)分離方法 ——親和層析法 。 四. 凝膠過濾 五. 是指利用高度水化的，具有不同大小孔徑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的惰性多聚物顆粒作為層析柱的填充物，把分子大小不同的蛋白質(zhì)混合物上樣到柱層析上，混合物中的各組分隨著洗脫液的流動，按分子大小以不同的速度向下移動，從而把各組分分開 （圖 249） 。 沉降平衡法 ，適用于沉降系數(shù)相近，但密度不同的蛋白質(zhì)。 離子強度 (μ) ＝ ΣCZn21/2 三、 蛋白質(zhì)的沉降作用及超離心分離 沉降速度 (ν = dx / dt )與蛋白質(zhì)分子的大小和密度有關(guān)。任何降低溶質(zhì)分子相互作用的因素以及加強溶質(zhì)分子與溶劑分子相互作用的因素都有助于增加溶解度。 鹽溶現(xiàn)象： 在鹽溶液很稀的范圍內(nèi)，隨著鹽濃度的增加，球狀蛋白質(zhì)的溶解度也隨之增加 （ 圖 248） ，此現(xiàn)象稱作 鹽溶 (saltingin) 。 二 、 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與鹽析分離 蛋白質(zhì)在水中可形成一種穩(wěn)定的親水膠體 。 弱酸性的陽離子交換劑一般適合于分離 pI＞ 。故蛋白質(zhì)混合物的洗脫分離可由改變洗脫液中的鹽類的離子強度和 pH來完成。蛋白質(zhì)樣品同離子交換纖維素的結(jié)合力取決于彼此相反電荷基團的靜電吸引，這與溶液的 pH有關(guān)，因 pH決定離子交換劑與蛋白質(zhì)的解離程度。在電泳之后 ,欲檢測目標蛋白的存在 ,可以先將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上 ,然后用目標蛋白產(chǎn)生的抗體與之產(chǎn)生抗原 抗體反應(yīng) ,最后可用連接有堿性磷酸酯酶或辣根過氧化酶的第二抗體 (通用抗體 )與第一抗體反應(yīng) ,加入能與抗體共接的酶反應(yīng)生成有色物質(zhì)的生色液 ,即可十分可靠地檢到的目標蛋白 (圖 246)。 ◎ 免疫印跡 (Immunoblotting)或蛋白質(zhì)印跡 (Western blotting)是檢測目標蛋白質(zhì)的一項十分有效的方法。對于一個混合蛋白質(zhì)的電泳分離來說 ,它只能檢測樣品的分離情況；如果被檢蛋白質(zhì)的位置可以確定 ,可以將該蛋白質(zhì)的色帶切下之后進行脫色 ,測定脫色液光吸收值 ,能對該蛋白質(zhì)進行定量分析。 ● 等電聚焦 是在聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種用于檢測蛋白質(zhì)的方法，它與 SDSPAGE結(jié)合構(gòu)成的雙向電泳技術(shù)可用于確定蛋白質(zhì)的亞基組成及電荷異構(gòu)體的分析 （圖 245） 。 ● 變性電泳： SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDSPolyacrylamide Gel Electrophoresis,SDSPAGE)， SDS是一種帶負電荷的陰離子去垢劑，分子式： CH3(CH2)10CH2OSO3－ Na＋ ， 它能使蛋白質(zhì)變性、肽鏈伸展，并吸附在伸展的肽鏈上，吸附的量與鏈長成比例。以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，可進行非變性電泳和變性電泳。 1. 蛋白質(zhì)的電泳分離 凝膠電泳是目前常用的一種生化方法。 作為兩性電解質(zhì)，每種蛋白質(zhì)都有其等電點 (pI) ，這與它所含的氨基酸種類和數(shù)量有關(guān)。因此，在目標蛋白質(zhì)的整個分離純化過程中要在較低溫度下 (0－ 4℃) 操作，注意使用蛋白酶 (使蛋白質(zhì)降解的酶 )的抑制劑，避免使用劇烈條件，以免蛋白質(zhì)特定的折疊結(jié)構(gòu)受到破壞。 ▲ 目標蛋白質(zhì)的分離純化程序主要包括 : ⑴材料的選擇； ⑵組織勻漿和破碎細胞獲取粗提取液；⑶蛋白質(zhì)初步提純；⑷選擇一種或幾種合適的方法除去雜蛋白 ,直至完全純化；⑸目標蛋白的鑒定。目標蛋白質(zhì)的分離決不是一件輕而易舉的事情，因為要把它與性質(zhì)、大小和結(jié)構(gòu)十分相似的其他蛋白質(zhì)分離開來存在許多困難。 Section 6 蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其分離純化 ▲ 蛋白質(zhì)的分離純化是對蛋白質(zhì)進行研究的一項必需的和基礎(chǔ)的工作。血紅蛋白與 氧 結(jié)合時的協(xié)同效應(yīng)是別構(gòu)作用的結(jié)果 。 蛋白質(zhì)在表達功能的過程中，其構(gòu)象發(fā)生變化的現(xiàn)象叫做 變構(gòu)作用或別構(gòu)作用 (allosteric efect)。因此，很可能當(dāng)一個亞基的氧結(jié)合部位同氧結(jié)合后就影響其他亞基對氧結(jié)合的親和力。血紅蛋白是一種四聚體分子，每個亞基都能同 O2分子結(jié)合。 S形的 結(jié)合曲線是一種蛋白質(zhì)的小分子結(jié)合部位之間協(xié)同作用的標志。血紅蛋白的兩個 αβ原體呈雙重旋轉(zhuǎn)對稱 （圖 239） 。 α亞基由 141個 氨基酸 殘基組成， β亞基由 146個 氨基酸 殘基組成。 鐵離子可形成六個配位鍵，其中一個與 O2結(jié)合 （圖 238） 。血紅素是含鐵的原卟啉。 二、 血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 肌紅蛋白是由 153個 aa殘基組成的單鏈蛋白， 整個分子被包裝成一個緊密的實體 (圖 237)。 氧的飽和百分數(shù)： Y= [HbO2／（ HbO2 + Hb） ] 100％ 分壓： 混合氣體中，各氣體單獨在同樣的溫度下占據(jù)混合氣體的體積時所具有的壓力。 肌紅蛋白 存在于肌肉等組織中，當(dāng)氧從毛細血管中擴散進入肌肉組織后，就被組織細胞內(nèi)的肌紅蛋白結(jié)合。 Section 5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 一、 血紅蛋白與肌紅蛋白的功能比較 血紅蛋白 是血液中紅細胞的主要蛋白質(zhì)。 Pro、 Gly往往出現(xiàn)在 β拐角處，而 Val則不會出現(xiàn)。 局部折疊的二級結(jié)構(gòu) —→ 熔融小球 —→ 三級結(jié)構(gòu)形成開始 —→具域結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu)形成 （圖 236） 。表明 二硫鍵不是正確折疊所必需的。 ： Anfinsen證明，變性的核糖核酸酶 A（ RNase A）只有處在天然構(gòu)象穩(wěn)定的條件下才能重新形成它的正確的二硫鍵，并恢復(fù)酶的活性。 蛋白質(zhì)的變性只破壞其空間結(jié)構(gòu)而不破壞它的一級結(jié)構(gòu)；蛋白質(zhì)的變性包括從有序到無序的轉(zhuǎn)變。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)加熱變性時，其構(gòu)象上的敏感特征如比旋度、粘度和紫外吸收等在一個很窄的溫度范圍內(nèi)急劇變化。 例如色 氨酸合酶是一種由兩種亞基構(gòu)成的四聚體蛋白 (α 2β 2)，純 粹 的α 亞基 催化下面的反應(yīng)： 吲哚甘油磷酸 ←→ 吲哚 ＋ 甘油醛 3磷酸 而純 粹 的 β 亞基 催化的反應(yīng)是 : 吲哚 ＋ L絲氨酸 ←→ L 色氨酸 吲哚既是 α 亞基的產(chǎn)物，又是 β 亞基的底物，它直接從 α 亞基進入到 β 亞基，當(dāng)它作為一個游離的中間物時，是不可能檢測到的。 例如，細菌谷氨酰胺合成酶的活性部位就是由相鄰亞基對構(gòu)成的，解離的單體是無活性的。 ? 匯聚酶的活性部位 . 許多酶的催化效力來自單個亞基的寡聚結(jié)合。 ? 協(xié)同性 . 這是寡聚體蛋白 (包括寡聚體酶 )的一個重要的性質(zhì)。 實際上，決定寡聚體的裝配以及亞基 亞基的相互作用的全部信息都包含在編碼單體所需的遺傳物質(zhì)中。 ? 遺傳上的經(jīng)濟性和有效性 . 蛋白質(zhì)單體的寡聚結(jié)合對一種生物來說，在遺傳上是經(jīng)濟的。 表面積 /體積比越小，那么一個物體的半徑就越大。 因此，蛋白質(zhì)只有旋轉(zhuǎn)對稱 (rotational symmetry)這樣一種類型的對稱方式 （圖 234） 。 2. 寡聚體蛋白質(zhì)亞基的對稱性： 在寡聚體蛋白質(zhì)中，雖然每個亞基本身是不對稱的，但是，整個寡聚體的四級結(jié)構(gòu)卻是對稱的，即原體 (或亞基 )在幾何學(xué)上占據(jù)寡聚體對等的位置。在血紅蛋白中，一個 α 亞基和一個 β 亞基組合成一個原體。 在研究寡聚體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中，有時使用 原體 (protomer)這一名稱。 由于寡聚蛋白質(zhì)是由多個亞基組成，每個亞基有其本身的折疊結(jié)構(gòu) (三級結(jié)構(gòu) )，所以 研究寡聚蛋白質(zhì)中亞基的數(shù)目和亞基間的相互關(guān)系 (即它們的空間位置 )就構(gòu)成了寡聚蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的內(nèi)容。 四、寡聚蛋白質(zhì) (oligomeric protein)和四級結(jié)構(gòu) 1. 四級結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)容： 生物體內(nèi)的許多蛋白質(zhì)都含有兩個或多個折疊的多肽鏈，它們彼此聚集，構(gòu)成一個完整的、有功能的實體，這種蛋白質(zhì)稱 寡聚蛋白質(zhì) 。 這種力是維持蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定的主要的作用力。偶極與偶極間的相互作用包括永久偶極間的相互作用、永久偶極與誘導(dǎo)偶極間的作用和瞬時偶極間的作用 （圖 232） 。 ▲偶極與偶極間的相