【正文】 17 申請(qǐng)者和主要合作者情況（ 、經(jīng)費(fèi)來(lái)源以及能用于本課題的時(shí)間； 3 。 DNA抽取，探針的制備，芯片雜交及洗滌，掃描分析結(jié)果均有河南大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和河南大學(xué)消化疾病研究所完成。熟練掌握細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱?。通過(guò)河南大學(xué)天然藥物研究所、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和河南大學(xué)植物逆境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行交叉學(xué)科協(xié)作。預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)與基本符合臨床實(shí)踐的結(jié)果，預(yù)實(shí)驗(yàn)階段已取得成效，為本課題實(shí)驗(yàn)順利實(shí)施提供有力保證。調(diào)整了“人肝癌細(xì)胞株 BEL7402體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)”各實(shí)驗(yàn)組藥物劑量濃度，亞砷酸治療組的濃度為 10μ mol/L、派羅欣治療組的濃度 10μ g/L、丹參治療組濃度 ，初步得知 亞砷酸+派羅欣 +丹參聯(lián)合可達(dá)到抗癌 藥物活性的優(yōu)化。 2020 年主持 河南省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 “ 基 因芯片對(duì)亞砷酸經(jīng)臍靜脈灌注治療原發(fā)性肝癌分子機(jī)制的研究 ”。 2020 年主持 河南省 科技廳的科技攻關(guān)項(xiàng)目“肝癌切除加臍靜脈植泵灌注治療原發(fā)性肝癌的臨床研究”。 實(shí)現(xiàn)本課題目標(biāo)已具備的條件和基礎(chǔ) （ ； 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備； ； ） 工作基礎(chǔ) 1前期研究 ： 近年來(lái)在“惡性梗阻性黃疸模型的建立及評(píng)價(jià)”研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)展“丹參在肝癌致梗阻性黃疸時(shí)對(duì)腫瘤血管形成作用的研究”，發(fā)表了“肝癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的新進(jìn)展” 等國(guó)家級(jí)核心刊物論文 12 篇，因“丹參對(duì)肝 癌致惡性梗阻性黃疸治療作用實(shí)驗(yàn)研究”課題，獲 2020年度全國(guó)醫(yī)學(xué)優(yōu)秀學(xué)術(shù)成果一等獎(jiǎng)。 S表示，使用 SPSS 。 第三部分（ 2020年度 2020年 9月） ： HCC+ PVTT臨床分組對(duì)照實(shí)驗(yàn)，探討藥物活性優(yōu)化經(jīng)臍靜脈治療 HCC+PVTT的治療作用的機(jī)制。 15 研究進(jìn)度及完成期限 （課題總進(jìn)度、年度計(jì)劃進(jìn)度） 5年度研究計(jì)劃 實(shí)驗(yàn)階段：（ 2020年 1月 — 2020年 9月） 第一部分（ 2020年 1月 — 2020年 4月） ：人肝癌細(xì)胞株 BEL7402體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討 亞砷酸 +派羅欣 +丹參的藥物活性優(yōu)化方案的抗腫瘤細(xì)胞效果。 從 臍靜脈再通技術(shù)，臍靜脈灌注化療門(mén)脈系血流動(dòng)力學(xué)改變等一系列問(wèn)題進(jìn)行 預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，解決經(jīng)臍靜脈植泵的治療途徑的問(wèn)題。對(duì) 臍靜脈置泵技術(shù)進(jìn)行研究：改進(jìn) 經(jīng)歷手術(shù)直視臍靜脈植泵，到腹腔鏡下輔助臍靜脈植泵 ，再 到 超聲定位下微創(chuàng)臍靜脈置泵技術(shù)改進(jìn)。增加應(yīng)用 IC50法來(lái)判定兩種藥物的聯(lián)合作用。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì) BEL7402細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)依賴關(guān)系。 為研究規(guī)范治療 HCC+PVTT的新策略， 通過(guò)人肝癌細(xì)胞株 BEL7402體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、高轉(zhuǎn)移人肝癌裸鼠模型 LCI— D20實(shí)驗(yàn)和 HCC+ PVTT臨床分組對(duì)照實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)和臨床系列研究， 揭示其治療作用的機(jī)制。 S表示，使用 SPSS ，對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行他 t檢驗(yàn)，對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行 RC? 表 χ 2檢驗(yàn)， ? 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3從形態(tài)學(xué)角度：觀察腫瘤體積、抑癌率、抑轉(zhuǎn)移率 3基因芯片技術(shù)分析：運(yùn)用腫瘤基因芯片（ BiostarⅠ）技術(shù)，高通量觀察高通 14 量觀察腫瘤凋亡相關(guān)基因、癌基因 、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因等相關(guān)基因譜表達(dá)，分析差異表達(dá)，研究 亞砷酸 +派羅欣 +丹參 經(jīng)臍靜脈灌注治療 HCC+ PVTT作用的分子機(jī)制。聯(lián)合用藥 qd 21 天，間隔 4周重復(fù)，總共 3個(gè)療程。間隔 4 周重復(fù)，總共 3個(gè)療程。聯(lián)合用藥 qd 21 天，間隔 4周重復(fù)，總共 3個(gè)療程。（一期手術(shù)行肝癌切除+門(mén)靜脈切開(kāi)取癌栓術(shù)后，術(shù)后藥物治療 3個(gè)療程， 一期不能手術(shù)，術(shù)前藥物治療 1個(gè)療程后，二 期手術(shù)行肝癌切除 +門(mén)靜脈切開(kāi)取癌栓術(shù)，術(shù)后藥物治療 2個(gè)療程，并計(jì)算 二期手術(shù)切除率）。探討藥物活性優(yōu)化經(jīng)臍靜脈治療HCC+PVTT的作用機(jī)制。 S表示，使用 SPSS ，對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行 t檢驗(yàn)，對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行 RC? 表 χ 2檢驗(yàn)， ? 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從分子 生物學(xué)角度觀察肝癌的四個(gè)指標(biāo)：①細(xì)胞增殖能力指標(biāo) 增殖細(xì)胞核抗原（ PCNA)，②腫瘤血管形成指標(biāo) 血管內(nèi)皮因子（ VEGF） ，③肝癌轉(zhuǎn)移傾向指標(biāo) 細(xì)胞間黏附分子 1(ICAM1） ，④促肝癌細(xì)胞凋亡指標(biāo) 13 凋亡指數(shù)（ Apoptosis Index）。對(duì)照組平均轉(zhuǎn)移率 100%)。 2，抑癌率 (抑癌率 =（對(duì)照組平均瘤體 — 實(shí)驗(yàn)組平均瘤體）247。 2肝癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移情況：肉眼觀察：記錄腫瘤體積，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目、轉(zhuǎn)移灶累及肝葉數(shù)以及全身各器官轉(zhuǎn)移情況。 ③ 藥物活性優(yōu) 化治療組： 12只，亞砷酸注射液，劑量 ，腹腔注射；派羅欣注射液 107U/ kg，頸部注射； 丹參注射液， 劑量 2ml/ kg，聯(lián)合用藥， 腹腔注射，連續(xù)給藥 14天。 2方法 利用復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所建立的高轉(zhuǎn)移人肝癌裸鼠模型 LCI— D20，將瘤源原位接種于 36只裸鼠肝內(nèi)，隨機(jī)分為 3組 : ① 空白對(duì)照組： 12只，等體積生理鹽水，腹腔注射，連續(xù)給藥 14天。鼠齡 5周 ,體重 1720g,在 SPF條件下裸鼠室內(nèi)飼養(yǎng)。派羅欣注射液（聚乙二醇化干擾素a）購(gòu)自 Hoffman Roche 公司上海分公司，丹參注射液 有上海第九制藥廠生 產(chǎn)。 第二部分 : 肝癌裸鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn) 目的：通過(guò)高轉(zhuǎn)移人肝癌裸鼠模型 LCI— D20，對(duì)空白對(duì)照組、 5Fu 陽(yáng)性對(duì)照組和藥物活性優(yōu)化治療組施行分組對(duì)照，從形態(tài)學(xué)角度觀察腫瘤體積、抑癌率、抑轉(zhuǎn)移率和從分子學(xué)角度對(duì)肝癌 的增殖能力、肝癌細(xì)胞凋亡、腫瘤血管的形成和肝癌轉(zhuǎn)移傾向進(jìn)行研究，探討亞砷酸 +派羅欣 +丹參的藥物活性優(yōu)化抗腫瘤的機(jī)制。 ⑶ 將樣品用 FAC scan型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞核 DNA含量，數(shù)據(jù)用 multicycle分析軟件處理。 35流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞比率和 DNA細(xì)胞周期分析。 ⑵ TUNEL檢測(cè) :參照試劑盒說(shuō)明書(shū)按下列步驟進(jìn)行。 ⑴ 細(xì)胞準(zhǔn)備 :將多聚賴氨酸粘片置 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng) BEL7402細(xì)胞，調(diào)至 5 104/ml，將細(xì) 胞加入培養(yǎng)板內(nèi)， 2m1/孔，分別加入亞砷酸治療組、派羅欣治療組、丹參治療組和藥物活性優(yōu)化組，培養(yǎng) 48h。亞砷酸 +派羅欣、亞砷酸 +丹參和派羅欣 +丹參的兩兩藥物合用均為 CI≤ 1，可推斷亞砷酸 +派羅欣 +丹參的抗腫瘤細(xì)胞的藥物活性優(yōu)化效應(yīng)。如果 CI1,認(rèn)為兩種藥物呈現(xiàn)拮抗作用 。 兩種藥物的相互作用為非排斥性 ,取α =1。應(yīng)用中效原理分析和計(jì)算兩種藥物的聯(lián)合作用指數(shù)。 ① 按公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率： 細(xì)胞抑制率 (%)=(1一實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值 /對(duì)照組平均吸光度值 ) 100%。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 BEL7402細(xì)胞，用 散細(xì)胞后計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為 5 104/ml，置入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 200ul/孔，待細(xì)胞貼壁后，分別加入亞砷酸治療組、派羅欣治療組、丹參治療組和藥物活性優(yōu)化組，同時(shí)設(shè)一組不加藥物的細(xì)胞組，作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，每組均 含 4個(gè)平行孔，置 5 % C02孵箱內(nèi)分別培養(yǎng) 24h,48h, 72h， 結(jié)束前 46小時(shí)，每孔加入 MTT (5mg/ml) lO ul，小心去除上清液， 11 加入 DMSOl00u1，輕輕震蕩至 MTT沉淀完全溶解，在多孔掃描分光光度計(jì)上，測(cè)定 570nm波長(zhǎng)下吸光度 A值。 3隨機(jī)分組原則 ①亞砷酸治療組： 亞砷酸注射液，濃度 10μ mol/L，觀察 3天 ②派羅欣治療組： 派羅欣注射液，濃度 10μ g/L， 觀察 3天 ③丹 參治療組： 丹 參注射液，濃度 ， 觀察 3天