【正文】 17 申請者和主要合作者情況（ 、經費來源以及能用于本課題的時間； 3 。 DNA抽取，探針的制備，芯片雜交及洗滌，掃描分析結果均有河南大學醫(yī)學分子生物學實驗室和河南大學消化疾病研究所完成。熟練掌握細胞體外培養(yǎng)技術和動物實驗模型制作。通過河南大學天然藥物研究所、醫(yī)學分子生物學實驗室和河南大學植物逆境重點實驗室進行交叉學科協作。預實驗檢測數據與基本符合臨床實踐的結果，預實驗階段已取得成效，為本課題實驗順利實施提供有力保證。調整了“人肝癌細胞株 BEL7402體外細胞實驗”各實驗組藥物劑量濃度，亞砷酸治療組的濃度為 10μ mol/L、派羅欣治療組的濃度 10μ g/L、丹參治療組濃度 ，初步得知 亞砷酸+派羅欣 +丹參聯合可達到抗癌 藥物活性的優(yōu)化。 2020 年主持 河南省衛(wèi)生廳醫(yī)學科技攻關計劃項目 “ 基 因芯片對亞砷酸經臍靜脈灌注治療原發(fā)性肝癌分子機制的研究 ”。 2020 年主持 河南省 科技廳的科技攻關項目“肝癌切除加臍靜脈植泵灌注治療原發(fā)性肝癌的臨床研究”。 實現本課題目標已具備的條件和基礎 （ ； 主要實驗設備； ； ） 工作基礎 1前期研究 ： 近年來在“惡性梗阻性黃疸模型的建立及評價”研究的基礎上，開展“丹參在肝癌致梗阻性黃疸時對腫瘤血管形成作用的研究”，發(fā)表了“肝癌浸潤轉移機制研究的新進展” 等國家級核心刊物論文 12 篇，因“丹參對肝 癌致惡性梗阻性黃疸治療作用實驗研究”課題，獲 2020年度全國醫(yī)學優(yōu)秀學術成果一等獎。 S表示，使用 SPSS 。 第三部分（ 2020年度 2020年 9月） ： HCC+ PVTT臨床分組對照實驗，探討藥物活性優(yōu)化經臍靜脈治療 HCC+PVTT的治療作用的機制。 15 研究進度及完成期限 （課題總進度、年度計劃進度） 5年度研究計劃 實驗階段：（ 2020年 1月 — 2020年 9月） 第一部分（ 2020年 1月 — 2020年 4月） ：人肝癌細胞株 BEL7402體外細胞實驗，探討 亞砷酸 +派羅欣 +丹參的藥物活性優(yōu)化方案的抗腫瘤細胞效果。 從 臍靜脈再通技術，臍靜脈灌注化療門脈系血流動力學改變等一系列問題進行 預實驗研究，解決經臍靜脈植泵的治療途徑的問題。對 臍靜脈置泵技術進行研究：改進 經歷手術直視臍靜脈植泵，到腹腔鏡下輔助臍靜脈植泵 ，再 到 超聲定位下微創(chuàng)臍靜脈置泵技術改進。增加應用 IC50法來判定兩種藥物的聯合作用。通過預實驗對 BEL7402細胞的抑制作用呈現明顯的劑量效應依賴關系。 為研究規(guī)范治療 HCC+PVTT的新策略， 通過人肝癌細胞株 BEL7402體外細胞實驗、高轉移人肝癌裸鼠模型 LCI— D20實驗和 HCC+ PVTT臨床分組對照實驗的基礎和臨床系列研究， 揭示其治療作用的機制。 S表示，使用 SPSS ，對計量資料進行他 t檢驗，對計數資料進行 RC? 表 χ 2檢驗， ? 認為差異有統計學意義。 3從形態(tài)學角度：觀察腫瘤體積、抑癌率、抑轉移率 3基因芯片技術分析：運用腫瘤基因芯片（ BiostarⅠ）技術，高通量觀察高通 14 量觀察腫瘤凋亡相關基因、癌基因 、抑癌基因、腫瘤轉移抑制基因等相關基因譜表達，分析差異表達，研究 亞砷酸 +派羅欣 +丹參 經臍靜脈灌注治療 HCC+ PVTT作用的分子機制。聯合用藥 qd 21 天，間隔 4周重復，總共 3個療程。間隔 4 周重復，總共 3個療程。聯合用藥 qd 21 天，間隔 4周重復，總共 3個療程。（一期手術行肝癌切除+門靜脈切開取癌栓術后，術后藥物治療 3個療程， 一期不能手術，術前藥物治療 1個療程后，二 期手術行肝癌切除 +門靜脈切開取癌栓術，術后藥物治療 2個療程，并計算 二期手術切除率）。探討藥物活性優(yōu)化經臍靜脈治療HCC+PVTT的作用機制。 S表示，使用 SPSS ，對計量資料進行 t檢驗，對計數資料進行 RC? 表 χ 2檢驗， ? 認為差異有統計學意義。從分子 生物學角度觀察肝癌的四個指標：①細胞增殖能力指標 增殖細胞核抗原（ PCNA)，②腫瘤血管形成指標 血管內皮因子（ VEGF） ，③肝癌轉移傾向指標 細胞間黏附分子 1(ICAM1） ，④促肝癌細胞凋亡指標 13 凋亡指數（ Apoptosis Index）。對照組平均轉移率 100%)。 2，抑癌率 (抑癌率 =（對照組平均瘤體 — 實驗組平均瘤體）247。 2肝癌生長轉移情況：肉眼觀察：記錄腫瘤體積，肝內轉移灶數目、轉移灶累及肝葉數以及全身各器官轉移情況。 ③ 藥物活性優(yōu) 化治療組： 12只，亞砷酸注射液，劑量 ，腹腔注射；派羅欣注射液 107U/ kg，頸部注射； 丹參注射液， 劑量 2ml/ kg，聯合用藥， 腹腔注射，連續(xù)給藥 14天。 2方法 利用復旦大學肝癌研究所建立的高轉移人肝癌裸鼠模型 LCI— D20，將瘤源原位接種于 36只裸鼠肝內，隨機分為 3組 : ① 空白對照組： 12只，等體積生理鹽水，腹腔注射，連續(xù)給藥 14天。鼠齡 5周 ,體重 1720g,在 SPF條件下裸鼠室內飼養(yǎng)。派羅欣注射液（聚乙二醇化干擾素a）購自 Hoffman Roche 公司上海分公司，丹參注射液 有上海第九制藥廠生 產。 第二部分 : 肝癌裸鼠動物模型實驗 目的：通過高轉移人肝癌裸鼠模型 LCI— D20，對空白對照組、 5Fu 陽性對照組和藥物活性優(yōu)化治療組施行分組對照，從形態(tài)學角度觀察腫瘤體積、抑癌率、抑轉移率和從分子學角度對肝癌 的增殖能力、肝癌細胞凋亡、腫瘤血管的形成和肝癌轉移傾向進行研究，探討亞砷酸 +派羅欣 +丹參的藥物活性優(yōu)化抗腫瘤的機制。 ⑶ 將樣品用 FAC scan型流式細胞儀檢測細胞核 DNA含量，數據用 multicycle分析軟件處理。 35流式細胞儀檢測凋亡陽性細胞比率和 DNA細胞周期分析。 ⑵ TUNEL檢測 :參照試劑盒說明書按下列步驟進行。 ⑴ 細胞準備 :將多聚賴氨酸粘片置 6孔細胞培養(yǎng)板，取對數生長 BEL7402細胞，調至 5 104/ml，將細 胞加入培養(yǎng)板內， 2m1/孔，分別加入亞砷酸治療組、派羅欣治療組、丹參治療組和藥物活性優(yōu)化組，培養(yǎng) 48h。亞砷酸 +派羅欣、亞砷酸 +丹參和派羅欣 +丹參的兩兩藥物合用均為 CI≤ 1，可推斷亞砷酸 +派羅欣 +丹參的抗腫瘤細胞的藥物活性優(yōu)化效應。如果 CI1,認為兩種藥物呈現拮抗作用 。 兩種藥物的相互作用為非排斥性 ,取α =1。應用中效原理分析和計算兩種藥物的聯合作用指數。 ① 按公式計算藥物對細胞的抑制率： 細胞抑制率 (%)=(1一實驗組平均吸光度值 /對照組平均吸光度值 ) 100%。取對數生長期 BEL7402細胞，用 散細胞后計數，調整濃度為 5 104/ml，置入 96 孔細胞培養(yǎng)板， 200ul/孔，待細胞貼壁后，分別加入亞砷酸治療組、派羅欣治療組、丹參治療組和藥物活性優(yōu)化組，同時設一組不加藥物的細胞組，作為實驗對照組，每組均 含 4個平行孔，置 5 % C02孵箱內分別培養(yǎng) 24h,48h, 72h， 結束前 46小時，每孔加入 MTT (5mg/ml) lO ul，小心去除上清液， 11 加入 DMSOl00u1，輕輕震蕩至 MTT沉淀完全溶解，在多孔掃描分光光度計上，測定 570nm波長下吸光度 A值。 3隨機分組原則 ①亞砷酸治療組： 亞砷酸注射液，濃度 10μ mol/L，觀察 3天 ②派羅欣治療組： 派羅欣注射液，濃度 10μ g/L， 觀察 3天 ③丹 參治療組： 丹 參注射液，濃度 ， 觀察 3天