【正文】 ⑩ （有毒?。⒛ぴ陲@影液中浸泡 5s～1min（顯影時(shí)間需根據(jù)具體情況而定，20～25℃溫度過低時(shí)需延長(zhǎng)時(shí)間） ，有條帶出現(xiàn)且明顯清晰時(shí)拿出，水洗，然后浸入定影液中 10min 左右，待膠片變得透明，水洗，晾干。⑧ 將 ECL 試劑盒的 A 液與 B 液等體積混合（盡量節(jié)約試劑，能覆蓋膜即可） ，加在有蛋白的一面的膜上，1～2min。⑥ 取出膜用 PBST 洗膜 2～3 次，5min/次。④ 取出膜用 PBST 洗膜 2～3 次，5min/次。② 取出膜用 PBST 洗膜 2～3 次，5min/次。⑨ 取下膜在麗春紅染液中浸泡 10min，用蒸餾水吸去浮色；膠則放入考馬斯亮藍(lán)染色觀察轉(zhuǎn)移效率。⑦ 合上夾子，黑面朝向轉(zhuǎn)膜槽黑面放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)子放入鋁飯盒中放在攪拌器 加入冷卻裝置電泳。⑤ 浸泡纖維墊。③ 切取小于膠的小的濾紙 6 張侵入 Transfer buffer 中 15min。4) 轉(zhuǎn)膜（濕法）① （大轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通）Transfer Buffer 置 4℃預(yù)冷去除氣體。⑧ 在有水潤濕的環(huán)境下翹開玻璃板，在膠的一端切角做記號(hào)。⑥ 樣品在濃縮膠中時(shí)用 6080V，溴酚蘭前沿進(jìn)入分離膠后用 120150V恒壓電泳（電泳時(shí)間一般 2～4 h，視電壓而定） 。④ 短暫離心，甩干管壁外水滴和甩下管壁內(nèi)的蛋白樣品。② 配制堆積膠，取出水相，加入堆積膠，不要有氣泡，立刻插入梳子，待膠凝后放入電泳槽中加入電泳緩沖液，拔出梳子。29 / 323) 制膠和電泳① 根據(jù)所需濃度配制分離膠，加入玻璃板中至綠框中間，加水封住液面（加水時(shí)要輕柔，否則液面會(huì)被沖凹陷不能恢復(fù)） 。Whatman 濾紙過濾，保存于室溫棕色瓶中，可使用數(shù)周。室溫下長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。[內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)滿一個(gè) 75ml 的培養(yǎng)瓶約加入 30～50μl 的 lysis buffer]④ 可以看到離心管底部有粘稠的白色的沉淀，小心的吸出上清的蛋白溶液至一個(gè)新的小道夫管中，注意不要吸入沉淀。13) 麗春紅 S 染色液：%麗春紅 S，3％三氯乙酸，3％磺基水楊酸，室溫保存。11) 脫色液：45％甲醇，45％去離子水，10％醋酸。分裝 205ul/管。6) 應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)電泳圖像進(jìn)行光密度掃描分析，計(jì)算待測(cè)基因的表達(dá)量。3) 加樣（依據(jù)梳子大小，調(diào)節(jié)加樣量）：5μl 樣品+1μl 6loading buffer，混勻后依次加入孔中。待融化的瓊脂糖溶也稍微冷卻，加入 EB 溶液，充分混勻。7. 電泳1) 取 50TAE 電泳液 10ml，用雙蒸水稀釋至 500ml，取一定量稀釋液加入電泳槽中。延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。PCR 延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般 1Kb 以內(nèi)的 DNA 片段，延伸時(shí)間 1min 是足夠 的。復(fù)性時(shí)間一般為 30～60sec ，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。變性后溫度快速冷卻至 40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。此步若不能使靶基因模板或 PCR 產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致 PCR 失敗。A： 變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致 PCR 失敗的最主要原因。Mg 2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。原材料可以是粗制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制劑以及能結(jié)合 DNA 的蛋白，將可能干擾PCR 反應(yīng)。4) 模板：PCR 對(duì)模板的要求不高，單、雙鏈 DNA 均可作為 PCR 的樣品。但是，不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對(duì) PCR 反應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當(dāng)作預(yù)試驗(yàn)或使用廠家推薦的濃度。3) Taq DNA 聚合酶酶：在 100μl 反應(yīng)體系中，一般加入 24U 的酶量，足以達(dá)到每 min 延伸 1000～4000 個(gè)核苷酸的摻入速度。此外，dNTP 能與 Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度降低。PCR 中常用終濃度為 50～400μM 的dNTP。據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般以 ～2mM（終濃度）較好。若樣品中含 EDTA 或其它螯合物，可適當(dāng)增加 Mg2+的濃度。濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含： 50mM KCl， 10mM TrisHCl（ 室溫）， MgCl2。以下體系僅供參考。6. PCRPCR 反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（10PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐熱 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板）五部分組成。反應(yīng)總體積為 50ulTotal RNA 4μgOligo(dT)18 2μl 輕輕混勻，70℃反應(yīng) 5min，冰上冷卻。以下以 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和 Oligo(dT)引物為例：反應(yīng)總體積為 50ulTotal RNA 4μgOligo(dT)18 2μl 輕輕混勻，70℃反應(yīng) 5min，冰上冷卻。如果，那么蛋白質(zhì)含量較高；如果，那22 / 32么核酸分解較多。3. RNA 提取(參照 TRIzol 試劑盒)細(xì)胞（110 7）21 / 32加入 TRIzol 1ml室溫靜置 5min，轉(zhuǎn)移到 的 eppendorf 管中加入氯仿 200μl 用力振搖 15s，室溫放置 2～3min4℃，12022rpm，15min，離心轉(zhuǎn)移上層水相（約 400～500μl）到 的 eppendorf 管中加等體積的異丙醇（約 500μl） ，室溫放置 10min4℃，12022rpm，10min，離心棄上清液，加預(yù)冷的 75%乙醇 1ml渦旋，4℃，7500rpm，5min，離心空氣干燥 5～10min，加 20μl 1‰DEPC 水溶解4. 測(cè)定提取 RNA 的濃度和純度1) 打開紫外分光光度計(jì)電源，預(yù)熱 20min；2) 取 1μl RNA 樣本，加 1ml 雙蒸水或 1‰DEPC 水稀釋，用雙蒸水或1‰DEPC 水做空白對(duì)照；3) 讀取 OD260、OD 280 值，每個(gè)樣本讀取 3 次，求均值；4) 計(jì)算 RNA 濃度：RNA 濃度（μg/μl）= OD2601000（稀釋倍數(shù)）40（1 個(gè)單位 OD260單鏈 RNA 是 40μg） 。2) 玻璃制品洗凈后泡酸過夜，自來水、蒸餾水及雙蒸水洗凈后，在 1‰DEPC 水中浸泡過夜，烘干后，用錫箔紙包裹，180℃烘烤 8h。%溴酚藍(lán)+40%（m/V ）蔗糖溶液。將熱的凝膠液倒入已放置好梳子的電泳板中，室溫放置 30min 左右后進(jìn)行電泳。PCR 產(chǎn)物大小與電泳分析中瓊脂糖濃度產(chǎn)物大小/Kb 瓊脂糖濃度/%5~60 1~20 ~10 ~7 ~6 ~3 ~2 瓊脂糖溶液的配制（2%）：取 1g 瓊脂糖，倒入錐形瓶中，加入 50ml 1TAE 緩沖液，電爐或微波爐中煮至沸騰。4) 瓊脂糖溶液：20 / 32瓊脂糖凝膠可以灌制成不同大小和孔徑。用 NaOH 調(diào)節(jié)溶液至 ，再用蒸餾水定容至200ml。2) 75%乙醇溶液（RNA 提取時(shí)現(xiàn)配）： 無水乙醇+‰DEPC水。2. 準(zhǔn)備工作1. 試劑配制1) 1‰DEPC 水的配制： 1000ml 去離子水中加入 1mlDEPC，靜放使其完全溶解，室溫保存。引物設(shè)計(jì)一般可以先參考文獻(xiàn)中的。⑨ 引物 3′端不可修飾。⑦ 引物之間不能有連續(xù) 4 個(gè)堿基的互補(bǔ)。⑤ 堿基要隨機(jī)分布。③ 引物長(zhǎng)度一般在 15~30 堿基之間。綜上所述可以歸納十條 PCR 引物的設(shè)計(jì)原則：19 / 32① 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。但 3’端絕對(duì)不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?3′端開始的。一般引物長(zhǎng)度為 15~30 堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 100~600 堿基對(duì)。如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。同時(shí)應(yīng) 預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到 PCR 的特異性與成功與否。3) 加入 DMSO 振蕩后，請(qǐng)及時(shí)測(cè)定，否則顏色會(huì)越來越深，影響測(cè)定結(jié)果。MTT工作液：用無血清培養(yǎng)基按照1：10稀釋后使用?？傊瑑龃鏁r(shí)掌握一個(gè)原則，慢凍（降溫速度為 1～3℃/min） 。4) 將凍存管放入 4℃ 冰箱 30min，再轉(zhuǎn)移至20℃，放置 2h，最后轉(zhuǎn)移至70℃ 存放（有條件的話，在70℃過夜后，可將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期保存） 。2) 在超凈臺(tái)中，倒掉上清液，加入凍存液（培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1） ，吹打均勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中（體積不宜過滿） 。第 8 節(jié) 細(xì)胞復(fù)蘇與凍存1. 細(xì)胞復(fù)蘇（快速復(fù)蘇）1) 取一 250ml 燒杯或一廢液缸裝上 38~39℃溫水；2) 從70 ℃或液氮罐中迅速取出所需細(xì)胞凍存管，放入溫水中，快速搖晃，使其盡可能快的融化（最好控制在 1min 左右） ；3) 完全融化后，立即從水中取出，1000rpm，離心 5min；4) 凍存管外面用 75%酒精噴灑并擦拭，移至超凈臺(tái)中；17 / 325) 在酒精燈火焰上灼燒后，小心揭掉凍存管上的膠布，將凍存管中上清液倒掉，加入培養(yǎng)基，輕輕吹打；6) 再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入充足的培養(yǎng)基，吹打均勻，孵箱培養(yǎng)。3. 試劑的配制： 4％臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取 4 克臺(tái)盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至 100 毫升，用濾紙過濾，4℃保存。16 / 32B： 吸取的液體不宜過多，否則計(jì)數(shù)不準(zhǔn)，要靠蓋玻片下毛細(xì)管作用將液體填充到小室中。 注意：A： 計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)注意一個(gè)原則“壓上不壓下，壓左不壓右” ，也就是說計(jì)數(shù)時(shí)，如果將方格上方邊緣線上細(xì)胞統(tǒng)計(jì)了，那么方格下方