【正文】 %；將 CAPS1Ⅲ進行氨基酸成分分析獲知，與 CAPS1 相比，CAPS1 Ⅲ中 Glu 和 Leu 的含量顯著增加，分別由 %增至 %，由 %增至 %，疏水性氨基酸比例降低，降低率為 %。 %。綜合體內體外抗氧化活性評價結果分析獲知，CAPS1 為活性最優(yōu)組分。 U/mL；CAPS1MD 組的 MDA 含量顯著降低（P） ，可降至 177。結果表明：與空白組相第 7章 結論28比，CAPS1 中劑量（CAPS1MD）組的 GSHPx 活力顯著增加（P ） ，可達最高值 177。 %。（2）高活性玉米抗氧化肽（CAPS）的優(yōu)選的研究以最佳酶解工藝所獲得的玉米蛋白酶解物為原料，以經(jīng)超濾分離技術制備獲得的CAPS1，CAPS2，CAPS3 ，CAPS4 和 CAPS5 五種不同分子量范圍的超濾液為研究對象，借助于 DPPH 清除率檢測方法，進行體外抗氧化活性評價。 %。 %。通過堿性蛋白酶酶解工藝的響應面實驗獲得回歸方程為：Y= 1+++，X 1 為酶解溫度（℃） ；X 2 為酶解 pH 值；X 3 為酶比底物濃度[E]/[S] （%） 。全文結論可分為 5 項內容：（1）高效水解玉米蛋白粉的關鍵技術研究通過 DH 單因素實驗獲得三種蛋白酶的最優(yōu)工藝參數(shù)：堿性蛋白酶：溫度 60 ℃，pH值 9，[E]/[S] 12 %；中性蛋白酶：溫度 30 ℃，pH 值 7，[E]/[S] 10 %；木瓜蛋白酶：溫度60 ℃，pH 值 9，[E]/[S] 10 %。實驗結果為深入研究 CAPS的活性成分和 PEF 處理機制提供了有利依據(jù)。 %，較處理前提高了 %。Qin 等人研究了高壓脈沖電場對顆粒體系食品中微生物的活性，證實原料中的空氣和液體蒸汽含量大小直接影響物質內部的介電常數(shù)，導致產(chǎn)生介質擊穿 [95]。本實驗中，電場強度和電場頻率對 CAPS2 的 DPPH 清除率影響顯著，分析原因為電場和脈沖電場頻率的刺激能夠減弱蛋白聚集體內部的相互作用力，加強蛋白分子的親水性和分子間作用力，改變細胞膜表面的電極化作用，能使原本在聚集體內部的活性氨基酸殘基暴露到表面，發(fā)揮活性作用，即體現(xiàn)為 CAPS2 活性的提高。當電場強度逐步增大時，埋藏在蛋白質內部的疏水殘基暴露到表面，形成水空氣界面膜。分析 PEF 處理提高抗氧化肽活性的作用原理，可能是因為 PEF 能夠改變蛋白質或肽類物質的物理和化學特性，在高壓脈沖下，能夠導致物質內部的結構被破壞，導致功能基團暴露，從而發(fā)揮活性作用 [8890]。圖 CAPS2 中紅外光譜圖Figure MIR spectroscopy of CAPS2注：光譜 1 代表經(jīng) PEF 處理的樣品，光譜 2 代表未處理樣品。 %，比 PEF 處理前提高了 %。分析獲知，電場強度和電場頻率的交互作用較為顯著。（2）響應面等高線圖和 3D 圖分析結果DPPH 清除率的響應面等高線圖和 3D 圖如圖 所示，可見 PEF 各參數(shù)的交互作用表現(xiàn)顯著。 predicated R2 = 。 R2=。 響應面的三元二次回歸模型的方差分析結果如表 所示，模型失擬度為 ，證明模型不顯著失擬，模型不顯著失擬是理想的結果，證明模型可以應用于數(shù)據(jù)分析。 14 0 1 1 177。 12 1 0 1 177。 10 0 0 0 177。 8 0 0 0 177。 6 1 1 0 177。 4 0 1 1 177。 2 1 0 1 177。（1）回歸模型構建與檢驗結果利用 DesignExpert 軟件對表 實驗結果進行統(tǒng)計分析，并構建回歸模型，得到回歸方程如下：Y=++++ X32；式中：自變量 X1 為料液濃度（mg/mL）；自變量 X2 為電場強度（kV/cm）；自變量X3 為電場頻率（Hz）。第 6章 基于高壓脈沖電場技術提高玉米抗氧化肽活性的研究21(a)(b)(c)圖 PEF 處理對 DPPH 清除率的影響Figure Effects of PEF processing on DPPH inhibition注：小寫字母代表 CAPS2 的顯著性，大寫字母代表 EWAPS 的顯著性；不同字母代表差異性顯著（P）。以 PEF 對 EWAPS 的 DPPH 清除率的影響情況作為對照，結果表明 PEF 處理對兩種肽的 DPPH 清除率均有提高和穩(wěn)定的作用，作用意義顯著（P） ，兩種肽的 DPPH 清除率的變化趨勢相同，最佳工藝參數(shù)也相同。 %，隨著電場強度繼續(xù)增加，DPPH 清除率先顯著下降（ P）后趨于穩(wěn)定；由圖 （c）可知，當電場頻率由 0 Hz 增至 2022 Hz 時，CAPS2 的 DPPH 清除率顯著增加（ P） ，在 2022 Hz 時達到最大值 177。 結果與分析 PEF 的單因素實驗結果PEF 的單因素實驗結果如圖 所示，由圖 （a）可知，當料液濃度由 6 mg/mL增至 8 mg/mL，CAPS2 的 DPPH 清除率變化不顯著（P ） ，在濃度為 8 mg/mL 時DPPH 清除率達到最高值 177。標準差（x 177。將經(jīng) PEF 最優(yōu)工藝參數(shù)處理后的 CAPS2 進行真空冷凍干燥制成 CAPS2(PEF)凍干粉，將 1 mg CAPS2(PEF)凍干粉和 200 mg 溴化鉀壓片作為處理樣，將 200 mg 溴化鉀壓片作為空白樣，將處理樣和空白樣在處理室內以 mm/s 的掃描速度自動識別，進行背景掃描和基線校正后獲得 MIR 光譜圖。 中紅外光譜（MIR）分析設置中紅外檢測器分辨率為 4 cm–1，測試范圍為 4004000 cm–1。以 PEF 對 EWAPS 的DPPH 清除率影響情況作為對照，考察 PEF 對 CAPS2 DPPH 清除率的影響作用。 單因素實驗設計以料液濃度、電場強度和電場頻率作為 PEF 系統(tǒng)的主要因素，以 DPPH 清除率為衡量指標設計三因素三水平單因素實驗，因素水平表如表 所示。 實驗方法 高壓脈沖電場處理實驗根據(jù)前期相關研究方法 [85,86]，將物料泵和 PEF 系統(tǒng)管路先后用蒸餾水和乙醇清洗兩第 6章 基于高壓脈沖電場技術提高玉米抗氧化肽活性的研究19至三遍，分別取 CAPS2 凍干粉和 EWAPS 凍干粉用蒸餾水配制成不同濃度的處理液，在室溫環(huán)境下，用物料泵抽取處理液，使處理液以 mL/min 的流速在電場處理裝置中循環(huán)流動。 材料與設備 材料與試劑CAPS2 凍干粉：由第三章超濾和真空冷凍干燥制備；EWAPS 凍干粉：由吉林大學軍需科技學院營養(yǎng)與功能實驗室提供；DPPH：分析純，購買于 Sigma 公司；溴化鉀：色譜級，購買于 Sigma 公司；氫氧化鈉、甲醇、無水乙醇：分析純，購買于北京化工廠。（3）獲得一條高效水解玉米蛋白粉的技術路線：玉米蛋白粉（經(jīng) 180 目篩選，蛋白質含量 %）→電子束輻照加工（輻照劑量 kGy）→稱量→用蒸餾水混勻→第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選17磁力攪拌（5 min）→水浴加熱致蛋白質變性（90 ℃、10 min）→冷卻→調節(jié) pH 值（1 mol/L NaOH 或 HCl）→堿性蛋白酶酶解（3 h，保持 pH 值恒定）→滅酶（90 ℃、10 min）→冷卻→離心（4 ℃、10000 g、10 min）→取上清液調節(jié) pH 值至 →玉米蛋白酶解物（DH40 %）。（2）在此基礎上探討了輻照劑量（ kGy）對玉米蛋白粉酶解過程中 DH 的影響，獲知當輻照劑量為 kGy 時，玉米蛋白粉的 DH 可達最高值 177。通過響應面實驗設計，構建了堿性蛋白酶回歸模型為：Y=+++ ，式中：X 1 為酶解溫度（℃ ） ；X 2 為酶解 pH 值；X 3 為酶比底物濃度[E]/[S]（%） ，最佳工藝參數(shù)為：酶解溫度 50 ℃，酶解 pH 值 ，酶比底物濃度 %，玉米蛋白粉的最大水解度可達 177。 本章小結（1）在高效水解玉米蛋白粉的關鍵技術研究中，以水解度（DH）為衡量指標，借助單因素實驗和響應面實驗設計等研究方法，對比分析了堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶 3 種蛋白酶對玉米蛋白粉酶解過程中的 DH 的影響情況。由于表面的孔隙增加，呈片狀分裂，玉米蛋白底物在酶解過程中與酶接觸的表面積增大，更易被蛋白酶水解，孔隙結構也利于酶進入顆粒內部，使肽鍵斷裂，更易形成小分子肽 [62]。本結果表明，副照處理對玉米蛋白粉分子表面結構的變化影響顯著，一方面能夠改變玉米蛋白粉顆粒的形狀，另一方面能夠改變玉米蛋白粉的表面狀態(tài)。朱軍等研究 60Co γ射線輻射對大豆蛋白性能的影響，發(fā)現(xiàn)輻射劑量的加強，蛋白質之間的二硫鍵發(fā)生斷裂，使疏水基團暴露，能提高蛋白的吸油性 [61]。第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選16本實驗創(chuàng)新性地利用了電子束輻照技術輔助增強酶解效果，結果顯示電子束輻照加工能夠顯著地提高玉米蛋白粉的水解度，這可能是因為電子束輻照能夠改變玉米蛋白粉的蛋白質結構，在酶解前輔助蛋白質發(fā)生變性。底物濃度和酶濃度互相關聯(lián)，通常情況下，酶分子越多，水解效果越好。溫度過低，酶的活性減弱，溫度過高，酶蛋白變性，使酶失活 [60]。有研究證實，適宜酶解環(huán)境包括酶解溫度、pH 值、酶濃度和底物濃度。每種酶對肽鏈的酶切位點均不相同，通過對比不同種類蛋白酶的酶解效果即可確定酶解玉米蛋白粉的最優(yōu)酶。玉米蛋白粉所含蛋白質主要是玉米醇溶蛋白、球蛋白、谷蛋白和白蛋白，其中玉米醇溶蛋白具有特殊的結構和較強的疏水性，導致玉米蛋白粉水溶性差，但是玉米醇溶蛋白又具備獨特的抗氧化活性，可以成為生物活性肽的制備原料 [58]。 討論蛋白質是玉米蛋白粉中的主要化學成分，含量大約為 60 %[2]。（3）響應面實驗最優(yōu)工藝參數(shù)對通過 DesignExpert 軟件構建的回歸模型求偏導，獲得堿性蛋白酶酶解玉米蛋白粉的最佳工藝參數(shù)：溫度 50 ℃，pH 值 ，[E]/[S] (%)，在此條件下 DH 為 177。經(jīng)過相應面優(yōu)化后的 DH 理論最大值為 %。實驗結果證明，堿性蛋白酶的各交互作用顯著。 adequate. precision = .*表示顯著性水平為 P.第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選14（2）響應面的等高線圖和 3D 圖分析結果（a）酶解溫度與酶解 pH 值交互作用（b）酶解溫度與[E]/[S]交互作用（c）酶解 pH 值與[E]/[S]的交互作用圖 響應值 DH 的響應面等高線圖和 3D 圖Figure RSM contours and 3D figures of DH value第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選15利用 DesignExpert 軟件對表 的結果優(yōu)化分析，回歸模型的交互作用的響應面等高線圖和 3D 圖如圖 所示。 adjusted R2=。第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選13表 響應面實驗數(shù)據(jù) Table Experimental data for DH from BBDDH（% ）序號 X1 X2 X3 實測值 預測值1 1 0 1 2 0 0 0 3 1 0 1 4 0 0 0 5 1 0 1 6 1 1 0 7 0 1 1 8 0 1 1 9 1 1 0 10 0 1 1 11 1 0 1 12 1 1 0 13 0 1 1 14 1 1 0 15 0 0 0 表 回歸模型顯著性結果Table Results of significance for regression model變異來源 平方和 均方 F 值 P 值 ProbFModel *X1 X2 *X3 X12 X22 X32 X1 X2 X1 X3 *X2 X3 Residual Lack of fit *Corr. total 注：R=。（1）回歸模型構建與檢驗結果以 DH 為響應值，利用 DesignExpert 軟件對表 的實驗結果進行統(tǒng)計分析，并構建回歸模型，分別得到回歸方程如下：Y=+++ ；式中：自變量 X1 為酶解溫度（℃） ；自變量 X2 為酶解 pH 值；自變量 X3 為[E]/[S]（%） 。第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選11（a）堿性蛋白酶（b）中性蛋白酶（c）木瓜蛋白酶圖 [E]/[S]對 DH 的影響Figure Effects of [E]/[S] on DH注：不同小寫字母代表差異性顯著（P）。由圖 （c ）可知，木瓜蛋白酶酶解物 DH 受[E]/[S] 的影響變化顯著，當[E]/[S]升至 10 %時，DH 達到最高值 177。E]/[S] 為 10 %時 DH 達到最大值 177。 %。（a）堿性蛋白酶第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選10（b）中性蛋白酶（c）木瓜蛋白酶圖 pH 值對 DH 的影響Figure Effects of pH value on DH注：不同小寫字母代表差異性顯著（P） 。木瓜蛋白酶的單因素結果如圖 （c）所示，隨著 pH 的增