【正文】 研究酶活性部。第十章 酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)節(jié)提要酶的活性部位對(duì)于不需要輔酶的酶來(lái)說(shuō)，就是指酶分子中在三維結(jié)構(gòu)上比較靠近的幾個(gè)氨基酸殘基負(fù)責(zé)與底物的結(jié)合與催化作用的部位，對(duì)于需要輔酶的酶來(lái)說(shuō)，輔酶分子或輔酶分子上的某一部分結(jié)構(gòu)，往往也是酶活性部位的組成部分。例如β鹵代DAla是細(xì)菌中丙氨酸消旋酶（AR）的不可逆抑制劑，屬于磷酸吡哆醛類(lèi)的自殺性底物。Kcat型不可逆抑制劑具有天然底物的類(lèi)似結(jié)構(gòu)，其本身也是酶的底物，能與酶結(jié)合發(fā)生類(lèi)似于底物的變化。例如：胰蛋白酶要求催化的底物具有一個(gè)帶正電荷的側(cè)鏈，如Lys、Arg側(cè)鏈。什么是過(guò)度態(tài)底物類(lèi)似物？它屬于何種類(lèi)型抑制劑？答：Ks型抑制劑根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，具有底物類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，可以和相應(yīng)的酶結(jié)合，同時(shí)還代有一個(gè)活潑的化學(xué)基團(tuán)，能與酶分子中的必需基團(tuán)反應(yīng)進(jìn)行化學(xué)修飾，從而抑制酶。103mol/L時(shí)，要得到75%的抑制，需競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的濃度是多少？[104mol/L]解：i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=75% Vi/Vo=1/4 → Vo=4Vi……①再根據(jù)無(wú)抑制劑時(shí)的米氏方程：Vo=Vmax[S]/(Km+[S])……②加入競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑時(shí)：V=Vˊmax[S]/(Kˊm(1+[I]/Ki) +[S])……③，此時(shí)Vmax變小，Km不變。Vˊmax/ Vmax1） Vˊmax = VmaxKi=105 molL1104 molL1 。Vmax=13．假設(shè)2104 molL1的[I]抑制了一個(gè)酶催化反應(yīng)的75%，計(jì)算這個(gè)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的Ki？[105 molL1]解：i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=75% Vi/Vo=1/4 → Vo=4Vi……①再根據(jù)無(wú)抑制劑時(shí)的米氏方程：Vo=Vmax[S]/(Km+[S])……②加入非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑時(shí)：V=Vˊmax[S]/((Km+[S])(1+[I]/Ki))……③，此時(shí)Vmax變小，Km不變。Vmax=1/(1+1/x)試問(wèn)：底物濃度分別為102molL103molL1和106molL1時(shí)的反應(yīng)初速率是多少？[1107 molL1min1，5108 molL1min1]解：∵Km=1106molL1《[S]= ∴V=Vmax=將題中數(shù)據(jù)代入米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得：設(shè)[S]=xKmV=Vmax，它符合MichaelisMenten動(dòng)力學(xué)，其Km為1106molL1。（3） 在特別的酶濃度和飽和底物水平下胰凝乳蛋白酶反應(yīng)速率比DNA聚合酶在相同條件下更低。（1） 胰凝乳蛋白酶結(jié)合第五比DNA聚合酶有更高的親和性。[E]=k3[Km:5104molL1；Vmax:6μmolL1min1；kcat/Km: 2105 mol1Ls1；轉(zhuǎn)換數(shù):100s1]解：Vmax=kcat，求出下列參數(shù)（反應(yīng)混合物中酶量為103μmol）。[Ki= 103molL1][S]/molL1V/μmolL1min1無(wú)抑制劑有抑制劑（103 molL1）105105105105105解：（1）無(wú)抑制劑時(shí)：V=Vmax[S]/(Km+[S])，將表中數(shù)據(jù)代入此式可得Km=105 molL1，Vmax= 對(duì)表中數(shù)據(jù)用V對(duì)[S]作圖，求Km值，可判斷有抑制劑時(shí)，Km值明顯增大，故該抑制劑應(yīng)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。，當(dāng)?shù)孜餄舛萚S]=Km，競(jìng)爭(zhēng)抑制劑濃度[I]=Ki時(shí)，反應(yīng)的初速率是多少？[V=1/3Vmax]解：根據(jù)米氏方程可得：V=Vmax[S]/ (Km(1+[I]/Ki)+[S]),其中[S]=Km，[I]=KiV= VmaxKm/ (Km(1+Ki/Ki)+Km)=1/3 Vmax：（1）無(wú)抑制劑和有抑制劑的Vmax和Km值。這種作圖法與LineweaverBurk作圖法比較有何優(yōu)點(diǎn)？[Vmax=160μmolL1 min1,Km=105 molL1][S]/molL1V/μmolL1min11041301041101048910562105531053810532解：將米氏方程改寫(xiě)成：V=VmaxKm試計(jì)算：（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，（3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的濃度均為5104 molL1時(shí)的酶催化反映速率？這3中情況的Ki值都是3104 molL1，（4）上述3種情況下，抑制百分?jǐn)?shù)是多少？[（1） min1，24%；（2） min1，%；（3） min1，%]解：（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的米氏方程為：V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])代入數(shù)據(jù)得：V= min1i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=24%（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的米氏方程為：V=Vmax[S]/((Km+[S])(1+[I]/Ki))代入數(shù)據(jù)得：V= min1i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=%（3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S](1+[I]/Ki))代入數(shù)據(jù)得：V= min1i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=%6．今制得酶濃度相同、底物濃度不同的幾個(gè)反應(yīng)混合液，并測(cè)得反應(yīng)初速率，數(shù)據(jù)見(jiàn)下表。104/（Km+104）……②由①、②得：Km=105，Vmax=75 nmolL1min1（2）V=755105/（105+5105）= nmolL1min1（3）502=100 nmolL1min1（4）帶如米氏方程可驗(yàn)證。解：（1）由米氏方程得：15=Vmax[80%]解：fES=[S]/（Km+[S]）=100103/(102+100103)=80%→P測(cè)得如下數(shù)據(jù)：[S]/molL1V/nmolL1min1106105104103102（1） 計(jì)算Km及Vmax。在研究酶促反應(yīng)速率及測(cè)定酶的活力時(shí)，都應(yīng)選擇酶的最適反應(yīng)條件。研究酶的抑制作用是研究酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶的催化機(jī)制、闡明代謝途徑以及設(shè)計(jì)新藥物的重要手段?？赡嬉种苿┲凶钪匾氖歉?jìng)爭(zhēng)性抑制，過(guò)度態(tài)底物類(lèi)似物為強(qiáng)有力的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。競(jìng)爭(zhēng)性抑制可以通過(guò)增加底物濃度而解除，其動(dòng)力學(xué)常數(shù)Kˊm變大，Vmax不變；非競(jìng)爭(zhēng)性抑制Km不變，Vˊmax變小；反競(jìng)爭(zhēng)性抑制Kˊm及Vˊmax均變小。酶促反應(yīng)速率常受抑制劑影響，根據(jù)抑制劑與酶的作用方式及抑制作用是否可逆，將抑制作用分為可逆抑制作用及不可逆抑制作用。kcat/Km常用來(lái)比較酶催化效率的參數(shù)。Km是酶的一個(gè)特征常數(shù)，以濃度為單位，Km有多種用途，通過(guò)直線作圖法可以得到Km及Vmax?；瘜W(xué)動(dòng)力學(xué)中在研究化學(xué)反應(yīng)速率與反應(yīng)無(wú)濃度的關(guān)系時(shí)，常分為一級(jí)反應(yīng)、二級(jí)反應(yīng)及零級(jí)反應(yīng)。（200/10）=9第九章 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)提要酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速率以及影響此速率各種因素的科學(xué)。[比活力：180U/mg蛋白質(zhì)，百分產(chǎn)量：17%，純化倍數(shù)：9倍]體積/ml活力單位/（U/ml）蛋白質(zhì)/（mg/ml）初提取液（NH4）2SO4鹽析1205200810104解：（1）810/=180U/mg （2）8105247。計(jì)算每g酶制劑所含淀粉酶活力單位數(shù)？[3000U]（淀粉酶活力單位定義：在最適條件下每小時(shí)分解1g淀粉的酶量稱(chēng)為1個(gè)活力單位）解：60247。（25/25）247。=400U/mg （3）247。（225/25）= 1500/60247。[400U/mg蛋白質(zhì)]（3）1g酶制劑的總蛋白含量及總活力。另取2ml酶液，若以每分鐘產(chǎn)生1μg 酪氨酸的酶量為1個(gè)活力單位計(jì)算，根據(jù)以上數(shù)據(jù)，求出：（1）1ml酶液中所含蛋白質(zhì)量及活力單位。mol）酶活性中心]解：（1）280010/151/（60106）1=105 mol （2）1103/1201036=5108 mol （3）105247。（2）每mg酶中有多少mol的活性部位（假設(shè)每個(gè)亞基上有一個(gè)活性部位）？[5108mol活性中心]。它的一個(gè)活力單位規(guī)定為：在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下，37℃、15min內(nèi)水解10μmol焦磷酸所需要的酶量。（180%103）=[107 mol/L，其相對(duì)分子質(zhì)量為120103，由6個(gè)相同亞基組成。（1106/92103106）=，其轉(zhuǎn)換數(shù)為6104min1，試計(jì)算該酶在細(xì)胞內(nèi) 濃度（假設(shè)新鮮組織含水80%，并且全部在細(xì)胞內(nèi)）。[500U/mg]（2）轉(zhuǎn)換數(shù)。， AgNO3，求該酶的最低相對(duì)分子質(zhì)量。這種抑制叫反饋抑制。（8） 誘導(dǎo)契合說(shuō)：1958年Koshland提出，當(dāng)酶分子與底物分子接近時(shí)，酶蛋白受底物分子誘導(dǎo)，其構(gòu)想發(fā)生有利于底物結(jié)合的變化，酶與底物在此基礎(chǔ)上互補(bǔ)契合進(jìn)行反應(yīng)。（6） Kat單位：在最適條件下，酶秒鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，為Kat單位。（3） 活化能：在一定溫度下1mol底物全部進(jìn)入活化狀態(tài)所需要的自由能（kj/mol）（4） 酶的轉(zhuǎn)化數(shù)：在一定條件下每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)。：（1） 生物酶工程：酶學(xué)和以DNA重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。酶RNA的發(fā)現(xiàn)，提出了生物大分子和生命起源的新概念，無(wú)疑促進(jìn)對(duì)生物進(jìn)化和生命起源的研究。它的發(fā)現(xiàn)，表明RNA是一種既能攜帶遺傳信息又有生物催化功能的生物分子。底物濃度太低時(shí)，5%以下的底物濃度變化實(shí)驗(yàn)上不易測(cè)準(zhǔn)，所以在測(cè)定酶的活力時(shí)，往往使第五濃度足夠大，這樣整個(gè)酶反應(yīng)對(duì)底物來(lái)說(shuō)是零級(jí)反應(yīng)，而對(duì)酶來(lái)說(shuō)卻是以及反應(yīng)，這樣測(cè)得的速率就比較可靠地反映酶的含量。只有在最適條件下測(cè)定才能真實(shí)反映酶活力的大小。？測(cè)定酶活力應(yīng)注意什么？為什么測(cè)定酶活力時(shí)以測(cè)定初速率為宜，并且底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度？答：酶活力指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可用在一定條件下所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率來(lái)表示；酶的比活力代表酶的純度，根據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)的規(guī)定比活力用每mg蛋白質(zhì)所含的酶活力單位數(shù)表示。第一個(gè)數(shù)字指明該酶屬于哪一個(gè)亞類(lèi)；第三個(gè)數(shù)字指出該酶屬于一個(gè)亞亞類(lèi)；第四個(gè)數(shù)字則表明該酶在亞亞類(lèi)中的排號(hào)。根據(jù)底物中別所用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)將每一大類(lèi)分為若干亞類(lèi)，每一個(gè)亞類(lèi)又按順序變成3……等數(shù)字；每一個(gè)亞基可再分亞亞類(lèi)，仍用3……編號(hào)，每一個(gè)每的分類(lèi)編號(hào)由4個(gè)數(shù)字組成，數(shù)字間由由“分別利用6來(lái)表示。？舉例說(shuō)明酶的國(guó)際系統(tǒng)命名法及酶的編號(hào)。它們的區(qū)別只在于它們與脫輔酶結(jié)合的牢固程度不同。通過(guò)透析方法可以除去，如輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ等。答：酶的調(diào)節(jié)和控制有多種方式，主要有：（1） 調(diào)節(jié)酶的濃度：主要有2種方式：誘導(dǎo)或抑制酶的合成；調(diào)節(jié)酶的降解；（2） 通過(guò)激素調(diào)節(jié)酶活性、激素通過(guò)與細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)受體相結(jié)合而引起一系列生物學(xué)效應(yīng)，以此來(lái)調(diào)節(jié)酶活性；（3） 反饋抑制調(diào)節(jié)酶活性：許多小分子物質(zhì)的合成是由一連串的反應(yīng)組成的，催化此物質(zhì)合成的第一步的酶，往往被他們終端產(chǎn)物抑制；（4） 抑制劑和激活劑對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)：酶受大分子抑制劑或小分子物質(zhì)抑制，從而影響酶活性；（5） 其他調(diào)節(jié)方式：通過(guò)別構(gòu)酶、酶原的激活、酶的可逆共價(jià)修飾和同工酶來(lái)調(diào)節(jié)酶活性。它有利于闡明生物體內(nèi)有序的代謝過(guò)程，酶的作用機(jī)制等。通過(guò)對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能的研究，確信酶與底物作用的專(zhuān)一性是由于酶與底物分子的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)，誘導(dǎo)契合，通過(guò)分子的相互識(shí)別而產(chǎn)生的。？酶的專(zhuān)一性有哪些？如何解釋酶作用的專(zhuān)一性？研究酶的專(zhuān)一性有何意義？答：酶的專(zhuān)一性是指酶對(duì)催化的反應(yīng)和反映物有嚴(yán)格的選擇性。隨著化學(xué)工程技術(shù)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，酶工程發(fā)展更為迅速，必將成為一個(gè)很大的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。酶工程是將酶學(xué)原理與化學(xué)工程技術(shù)及基因重組技術(shù)有機(jī)結(jié)合而形成的新型應(yīng)用技術(shù)，是生物工程的支柱。現(xiàn)已研制出催化多種反應(yīng)的抗體酶。根據(jù)酶催化的過(guò)度態(tài)理論，設(shè)計(jì)各種過(guò)度態(tài)類(lèi)似物作為半抗原免疫動(dòng)物，篩選具有催化活性的單抗。根據(jù)發(fā)夾狀或錘頭狀二級(jí)結(jié)構(gòu)原理，可以設(shè)計(jì)出各種人工核酶，用作抗病毒和抗腫瘤的防治藥物將會(huì)有良好的應(yīng)用前景。有催化分子內(nèi)和分分子間反應(yīng)的核酶。酶活力大小來(lái)表示酶含量的多少。酶活力是指在一定條件下酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，可用反應(yīng)初速率來(lái)表示。已知大多數(shù)酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，因此用分離純化蛋白質(zhì)的方法純化酶，不過(guò)要注意選擇合適的材料，操作條件要溫和。用“誘導(dǎo)契合說(shuō)”解釋酶的專(zhuān)一性已被人們所接受。酶往往只能催化一種或一類(lèi)反應(yīng)，作用于一種或一類(lèi)物質(zhì)。按規(guī)定每種酶都有一個(gè)習(xí)慣名稱(chēng)和國(guó)際系統(tǒng)名稱(chēng)，并且有一個(gè)編號(hào)。脫輔酶部分決定酶催化的專(zhuān)一性，而輔酶（或輔基）在酶催化作用中通常起傳遞電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的作用。酶的化學(xué)本質(zhì)除有催化活性的RNA分子之外都是蛋白質(zhì)。酶是由生物細(xì)胞產(chǎn)生的，受多種因素調(diào)節(jié)控制的具有催化能力的生物催化劑。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知。（）。結(jié)果如下表所示：BSA濃度（mg]？為什么？（BSA）稀釋液。PI值：Ala： Ser： Phe： Leu： Arg： Asp： His：[（1）Ala、Ser、Phe和Leu以及Arg和His向負(fù)極，Asp移向正極；（2）電泳時(shí)，具有相同電荷的較大分子比較小分子移動(dòng)得慢，因?yàn)殡姾?質(zhì)量之比較小，因而引起每單位質(zhì)量遷移的驅(qū)動(dòng)力也較小。）（1）血清蛋白，；（2）β乳球蛋白，；（3）胰凝乳蛋白酶原，、。[肌球蛋白、過(guò)氧化氫酶、血清清蛋白、胰凝乳蛋白酶原、肌紅蛋白、細(xì)胞色素C]，從分子排阻層析柱上洗脫細(xì)胞色素C、β乳球蛋白和血清紅蛋白時(shí)，其洗脫體積分別為11537和24ml，問(wèn)未知蛋白的Mr是多少？假定所有蛋白質(zhì)都是球形的，并且都處于柱的分級(jí)分離范