【正文】 五 計(jì)劃進(jìn)度選題研究在時(shí)間和順序上的安排。其中內(nèi)鏡生物膜模型的建立通過(guò)大腸桿菌在內(nèi)鏡Teflon管上生物膜的形成與培養(yǎng)時(shí)間、流速、溫度的關(guān)系，研究形成了成熟穩(wěn)定的黏附于內(nèi)鏡Teflon管上的生物膜。醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室、校本部實(shí)驗(yàn)室，設(shè)備先進(jìn)、技術(shù)力量雄厚，P級(jí)實(shí)驗(yàn)室、共聚焦顯微鏡等儀器，在本課題需要時(shí)可隨時(shí)使用。本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有面積約420平方米，擁有細(xì)胞培養(yǎng)及小動(dòng)物室等多個(gè)相對(duì)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室和三個(gè)無(wú)菌工作間，現(xiàn)已具備：紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)（BIORAD）、超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、空氣浴與水浴搖床、生化免疫、病理、分子生物學(xué)、胃腸激索、微生態(tài)等實(shí)驗(yàn)室。在70年代初成立了消化專(zhuān)科的同時(shí)，成立了生化實(shí)驗(yàn)室，1979年組建全軍消化醫(yī)學(xué)專(zhuān)科中心后，先后建立了微生態(tài)實(shí)驗(yàn)室及病理檢驗(yàn)室，開(kāi)展了厭氧菌培養(yǎng)和腸道菌群分析，1990年初增建了相對(duì)獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)室、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、胃腸激素室，使消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室成為初具規(guī)模、在國(guó)內(nèi)消化界有較大影響力的臨床實(shí)驗(yàn)室。醫(yī)科大學(xué)內(nèi)科消化學(xué)組始建于50年代。（5） 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 軟件進(jìn)行處理,同種處理因素不同水平采用方差分析中的oneway ANOVA進(jìn)行檢驗(yàn),不同處理因素間的兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)。結(jié)果判斷：0~45RLU為合格，≥46RLU為不合格。打開(kāi)蓋子，將Ultrasnap拭子放入ATP生物熒光法檢測(cè)儀中后關(guān)閉蓋子。實(shí)際菌落數(shù)(cfu/cm3)=肉眼可計(jì)菌落數(shù)稀釋倍數(shù)/體積，取實(shí)際菌落數(shù)的常用對(duì)數(shù)(log cfu/cm3)為標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)單位。細(xì)菌計(jì)數(shù)的結(jié)果用實(shí)際菌落數(shù)的常用對(duì)數(shù)(log cfu/cm3)為標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)單位來(lái)表達(dá)。待瓊脂凝固，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)。（4） 評(píng)價(jià)方法① 細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)：收集后的菌液進(jìn)行細(xì)菌梯度稀釋。f) 1cm長(zhǎng)的Teflon管行熒光染色后進(jìn)行CLSM檢查。振蕩后的懸浮液。d) 3cm長(zhǎng)的Teflon管為收集管腔內(nèi)的細(xì)菌，試驗(yàn)管縱向切開(kāi)等分為兩部分，每段管腔的內(nèi)表面用一個(gè)2mm寬的消毒小木棒進(jìn)行擦刮，與擦刮棒一起放入盛有5mlPBS的試管中。將準(zhǔn)備好的Ultrasnap拭子擦拭Teflon管內(nèi)管腔，使用ATP生物熒光法檢測(cè)有機(jī)物殘余量。c) Ⅱ組為Olympus清洗刷組，Teflon管a、Teflon管b、Teflon管c分別浸泡在盛有無(wú)菌PBS的容器中各刷洗一次、二次、三次。將準(zhǔn)備好的Ultrasnap拭子擦拭Teflon管內(nèi)管腔，使用ATP生物熒光法檢測(cè)有機(jī)物殘余量。棄去Teflon管的兩端各5cm，用無(wú)菌手術(shù)刀片以Ⅰ組16cm，Ⅱ組16cm（a）、16cm（b）、16cm（c），Ⅲ組16cm（d）、16cm（e）、16cm（f），Ⅳ組16cm（g）、16cm（h）、16cm（i），分段切開(kāi)并標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，每次試驗(yàn)用的Teflon管在恒溫箱中以同樣方式盤(pán)放。b) 制作大腸桿菌菌懸液：用傾注平板法,調(diào)整細(xì)菌濃度為106CFU/ml備用。③ 來(lái)自于Pull Thru公司生產(chǎn)的統(tǒng)一規(guī)格、批號(hào)、日期的一次性使用內(nèi)鏡清洗刷。（2） 研究因素① 來(lái)自于Olympus公司生產(chǎn)的統(tǒng)一規(guī)格、批號(hào)、日期的可重復(fù)使用內(nèi)鏡清洗刷。② 分組方法Ⅰ組：滅菌水空白對(duì)照；Ⅱ組：Olympus可重復(fù)使用內(nèi)鏡清洗刷；Ⅲ組：Ruhof一次性使用含酶內(nèi)鏡清洗刷；Ⅳ組：Pull Thru一次性使用內(nèi)鏡清洗刷。每一樣本取六張照片，生物膜的覆蓋率使用Scion圖像處理軟件進(jìn)行計(jì)算。④ 激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）觀察：對(duì)收集到的內(nèi)鏡鉗子管道進(jìn)行熒光染色后使用CLSM觀察生物膜形成的有無(wú)和程度、管道有無(wú)刮痕和裂縫，分析整個(gè)生物膜的分布均勻與否。② 送維修內(nèi)鏡鉗子管道一般資料表格的設(shè)計(jì)：紙質(zhì)問(wèn)卷發(fā)放和電話調(diào)查相結(jié)合。③ 樣本收集例數(shù)：根據(jù)r=(預(yù)期的現(xiàn)患率),a=（參考值范圍）,d=（允許誤差）,全國(guó)范圍內(nèi)收集1068例樣本，每例樣本長(zhǎng)度為20cm。、技術(shù)路線1. 臨床內(nèi)鏡生物膜現(xiàn)狀調(diào)研（1） 調(diào)研對(duì)象的選?、?調(diào)研對(duì)象：選取送往內(nèi)鏡維修點(diǎn)維修的內(nèi)鏡鉗子管道。預(yù)計(jì)要解決的難題：如何去控制手工刷洗人為因素的一致性，防止因?yàn)椴僮鞫a(chǎn)生的偏倚。要學(xué)會(huì)將選題分解，一點(diǎn)一點(diǎn)去做。29:252255.[32][J].中國(guó)消毒學(xué)雜志，2004，21(1)：6062.[33]廖如燕，張賢昌，林錦炎，鐘昱文，[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué),2005,31(5):6063.[34]黃俊毅,[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009,21（9）：4045. [35]葛新,董小青,[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16(2):231232.[36]葛新，王丹敏,[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志,2007,24(2):122125.[37]陸燁,虞曉珍,[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(7):13481349.[38][J].浙江:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,2009.二 課題的基本內(nèi)容，預(yù)計(jì)解決的難題二、三部分解決怎么去進(jìn)行研究這個(gè)問(wèn)題。32:170176.[25]. Marshall, R. Stout, R. Mitchell. Mechanism of the initial events in the sorption of marine bacteria to surfaces. J. Gen. Microbiol. 1971:68:337–348.[26]Katsutoshi Hori, Shinya Matsumoto. Bacterial adhesion: From mechanism to control. Biochemical Engineering Journal 48 (2010) 424–434.[27]Bridier, F. DuboisBrissonnet, A. Boubetra, V. Thomas, R. Briandet. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. Journal of Microbiological Methods 2010:82:64–70.[28]D. DeBeer, P. Stoodley, Z. Lewandowski, Biotech. Bioeng 1994:44:636.[29]D. G. Davies, A. M. Chakrabarty, G. G. Geesey, Appl. Environ. Microbiol 1993:59:1181.[30]MairaLitran T, Allison DG, Gilbert P. Expression of the multiple antibiotic resistance operon (mar) during growth of Escherichia coli as a biofilm. J Appl Microbiol 2000。, H. Martiny. Surface fixation