【正文】 Sons. InC. 2022 ? Strachan T and Read AP. Human Molecular Geics 3. Garland Publishing, 2022 致謝 : 本幻燈片采用了西交大醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)與 分子生物學(xué)系部分老師的 ppt內(nèi)容，沒(méi)有一一 標(biāo)名，對(duì)他們付出的勤勞表示感謝！ 。 ? 9bp克隆測(cè)序，分析結(jié)果。 確定基因和產(chǎn)物的功能途徑和網(wǎng)絡(luò) , 有利于新藥的發(fā)展。 ? 不同組織或細(xì)胞在不同時(shí)間基因的轉(zhuǎn)錄有數(shù)量和表達(dá)程度的差異。 2. 狹縫印跡法 3. 組織原位雜交 4. RNase保護(hù)測(cè)定法 5. mRNA引物延伸分析 6. 應(yīng)用單鏈 DNA探針的 S1定位法 7. 設(shè)置內(nèi)參的 RTPCR ? 內(nèi)參基因 : betaactin, GAPDH, rRNA ? RNA制備、逆轉(zhuǎn)錄、 PCR、凝膠電泳、定量測(cè)定。 調(diào)控作用 ? 將環(huán)境中的色氨酸消耗完，然后開始自身合成。衰減子位于結(jié)構(gòu)基因 E和操縱基因 O之間的 L基因中。在ara操縱子基因表達(dá)調(diào)控中， CAP蛋白的調(diào)控作用不顯著。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，經(jīng)透酶作用進(jìn)入細(xì)胞，在 β半乳糖苷酶催化下轉(zhuǎn)變成半乳糖，后者作為誘導(dǎo)劑（ inducer）與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白與操縱基因解聚，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。 衰減子（ attenuator） ? 又稱弱化子，位于操縱子中第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因之前，是一段能減弱轉(zhuǎn)錄作用的序列。 –CAP蛋白 (catabolic gene activator protein，CAP) 分解代謝物基因活化蛋白 –ntrC蛋白 是大腸桿菌氮代謝基因激活蛋白，其自身活性可通過(guò) ntrB使其磷酸化（有活性）和去磷酸化（無(wú)活性）而被調(diào)節(jié) consensus TATA (Pribnow) box E. coli Promoters 倒位蛋白（ inversion protein） ? 是一種位點(diǎn)特異的重組酶。 阻遏蛋白（ repressor） ? 與 DNA結(jié)合后都是抑制轉(zhuǎn)錄，這種基因表達(dá)調(diào)控的方式稱為負(fù)調(diào)控。 基因表達(dá)調(diào)控的生理意義 ?適應(yīng)環(huán)境、維持生長(zhǎng)和增殖 ?維持個(gè)體發(fā)育與分化 基因表達(dá)調(diào)控的基本原理 ?基因表達(dá)的多級(jí)調(diào)控 ?基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本因素 –特異 DNA序列 –調(diào)節(jié)蛋白 –DNA蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用 –RNA聚合酶 Transcription 5’ GATCTGACTGACATAGACATAGAT 3’ coding (= nontemplate) strand 3’ CTAGACTGACTGTATCTGTATCTA 5’ template strand 5’ GAUCUGACUGACAUAGACAUAGAU 3’ mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 影響轉(zhuǎn)錄的因素 –啟動(dòng)子 –σ因子 –阻遏蛋白 –正調(diào)控蛋白 –倒位蛋白 –RNA聚合酶抑制物 –衰減子 操縱子 （ operon） 調(diào)控區(qū) 信息區(qū) 啟動(dòng)子 操縱基因 啟 動(dòng) 子 ? 決定轉(zhuǎn)錄方向及模板鏈： E. coli的啟動(dòng)子長(zhǎng)約4060bp，至少包括三個(gè)功能區(qū)。 ? 協(xié)調(diào)表達(dá) （ coordinated expression） 功能相關(guān)的一組基因，協(xié)調(diào)一致，共同表達(dá)。 ? 時(shí)間特異性 （ temporal specificity） 在多細(xì)胞生物，從受精卵到組織、器官形成的各個(gè)發(fā)育階段，相應(yīng)的基因嚴(yán)格按照一定的時(shí)間順序開啟或關(guān)閉。 ? 誘導(dǎo)表達(dá) （ induction expression） 有一些基因表達(dá)極易受環(huán)境影響，在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，基因的表達(dá)開放或增強(qiáng)。 RNA 的合成 ? 4種 NTP、 DNA模板、 RNA聚合酶 ? 轉(zhuǎn)錄單位：結(jié)構(gòu)基因、啟動(dòng)子、終止子 ? 按堿基配對(duì)原則 , 沿 5’3’方向 ? 真核生物有三型 RNA聚合酶 ? 分為起始階段、延長(zhǎng)階級(jí)和終止階段 ? 轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物經(jīng)加工成為成熟的 RNA 蛋白質(zhì)的合成 ? 合成體系：氨基酸、 mRNA、 tRNA、核糖體、某些酶與蛋白質(zhì)因子、 ATP、 GTP、 Mg ? mRNA編碼區(qū)的三個(gè)相鄰核苷酸組成密碼子 ? tRNA起接合器作用，核糖體是合成場(chǎng)所和裝配機(jī) ? 核糖體循環(huán)：起始、肽鏈延長(zhǎng)和終止 ? 翻譯后加工：折疊、共價(jià)修飾、水解和亞單位的聚合 基因表達(dá)及其調(diào)控的特點(diǎn) ? 管家基因 （ housekeeping gene） 在一個(gè)生物個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的基因。 ? 5SrRNA由 RNA pol Ⅲ 從 rDNA外轉(zhuǎn)錄出，無(wú)成熟過(guò)程。 ? 甲基化： A → mA、 G → mG（甲基轉(zhuǎn)移酶） ? 還原：形成 DHU環(huán) ? 異構(gòu)： U → Ψ ? 脫氨： A → I ? rDNA為高度重復(fù)序列，真核生物初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為 45SrRNA的串聯(lián) rRNA。切下幾個(gè)核苷酸，核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化 3180。 ? RNA內(nèi)切核酸酶切除反密碼環(huán)前身中內(nèi)含子，連接酶連接反密碼環(huán)。末端加尾 （ 剪切內(nèi)含子，拼接外顯子） 剪接 hnRNA mRNA 修飾 編輯 小結(jié)： ? 串聯(lián) tRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由 RNase P從tRNA單體的 5180。 apoB mRNA的編輯加工 5180。 （ RNA editing） ?遺傳信息在 mRNA水平上的改變過(guò)程，稱為 RNA編輯。靠近，利于 剪接。 ? 套索的形成及剪除機(jī)制 —— 二次磷酸酯轉(zhuǎn)移 ? snRNA(small nuclear RNA) 100－ 300bp的核內(nèi)小 RNA. 已發(fā)現(xiàn) U U U UU6 ?剪接體 ： snRNA和核內(nèi)蛋白質(zhì)構(gòu)成的小分子核糖核 蛋白體（ snRNP), 能 結(jié)合 hnRNA內(nèi)含子區(qū)段，使內(nèi)含子彎曲， 3180。 GU 剪接方式 內(nèi)含子的功能 ? 利于物種的進(jìn)化選擇 ? 基因表達(dá)的調(diào)控 剪接： ?hnRNA剪切內(nèi)含子，拼接外顯子，連接為成熟 mRNA的過(guò)程。 內(nèi)含子 的 分類： ? 按基因類型和剪接方式分為 4種 I、 II類；自身剪接 (線粒體 ,葉綠體 。 . 剪接 （ splicing）（ 核內(nèi) ） hnRNA (heteronuclear RNA): 雜化核 RNA: mRNA的前體 ,核內(nèi)出現(xiàn)的 mRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 . 成熟 mRNA與基因 DNA雜交電鏡所見 1043 185 51 129 118 143 156 ? 外顯子 (exon) 在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn) ,并表達(dá)為成熟 RNA的核酸序列。 ?在 polyA聚合酶催化下，以 ATP為原料在修飾點(diǎn)后逐個(gè)加上 AMP形成polyA尾 (100～ 200b)。末端帽子 m7GpppG的生成 G 功能 ?穩(wěn)定 mRNA結(jié)構(gòu) ?給核蛋白體提供識(shí)別信號(hào) . 3180。 三、真核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾 . 5180。 真核生物的轉(zhuǎn)錄終止 1 3 2 339。端轉(zhuǎn)錄出 AAUAAA及富 GU序列后，在 AAUAAA后約 11～ 13b的修飾點(diǎn)（ processing）被切斷，游離的mRNA戴帽、加尾。 . 真核生物轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)： 參與 RNA polⅡ 轉(zhuǎn)錄的 TFⅡ 轉(zhuǎn)錄因子 分子量 功能 TFⅡ A 12， 19， 35 穩(wěn)定 TFⅡ D結(jié)合 TFⅡ B 33 促進(jìn) polⅡ 結(jié)合 TFⅡ D 38 辨認(rèn) TATA盒 TFⅡ E 57(α )34(β ) ATPase TFⅡ F TFII H 30， 74 解旋酶 蛋白激酶活性 TFⅡ D TFⅡ A TFⅡ B polⅡ / TFⅡ F TFⅡ E TATA PIC TATA A D B F DNA RNA polⅡ E H TF IIH