基因轉(zhuǎn)染技術(shù)ppt課件(參考版)
2025-05-15 07:53本頁面
【正文】 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 適用細(xì)胞廣；轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清和抗生素；相對(duì)具有一定毒性 陽離子聚合物 陽離子聚合物與核酸等形成穩(wěn)定的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 為最新一代的轉(zhuǎn)染試劑，具有操作簡(jiǎn)單；穩(wěn)定性好；轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低的特點(diǎn)；通過調(diào)節(jié)聚合物 /DNA比例優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 適用細(xì)胞廣，細(xì)胞致死率高，操作復(fù)雜 病毒介導(dǎo)法 通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 特定宿主細(xì)胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；但攜帶基因不能太大；需考慮安全因素 磷酸鈣法 磷酸鈣 DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞。 5. 各種 轉(zhuǎn)染方法 比較 轉(zhuǎn)染方法 原理 應(yīng)用 特點(diǎn) 電穿孔法 細(xì)胞暴露在短暫的高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖中，將誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，這種電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 不適用于原代細(xì)胞； 操作較簡(jiǎn)便但 重復(fù)性差 細(xì)胞毒性較大；效率較低 DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法 抑制核酸酶 內(nèi)吞作用 瞬時(shí)表達(dá) 操作相對(duì)簡(jiǎn)單；但需高濃度DNA ； DEAE葡聚糖濃度 ；溫育時(shí)間 陽離子脂質(zhì)體法 帶正電的脂質(zhì)體和核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 適用細(xì)胞廣，但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大， 需 根據(jù)不同細(xì)胞類型 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件 顯微注射法或基因槍法 使用一根細(xì)針頭將 DNA， RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核；基因槍使用高壓 microprojectile將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。常用方法有原位雜交、 Northern雜交、免疫組織化學(xué)染色等，原位及Northern雜交是檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄出的 mRNA,后者則是檢測(cè)外源基因翻譯出的蛋白質(zhì)。 、 在篩選出轉(zhuǎn)化子后還需要鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中外源基因的表達(dá)狀況。常用的方法有原位雜交、 Southern雜交。 （ 3） 基因共轉(zhuǎn)染技術(shù) 將目的基因表達(dá)載體 DNA和標(biāo)記基因表達(dá)載體 DNA混合后共同轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中，分別使用標(biāo)記基因和目的基因?qū)?yīng)的選擇劑進(jìn)行兩次篩選，最后得到復(fù)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子。這樣的新技術(shù)發(fā)展很快，常用的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞篩選方法： （ 1） 標(biāo)記基因篩選法 在載體上引入一個(gè)標(biāo)記基因，或同時(shí)導(dǎo)入標(biāo)記基因，在轉(zhuǎn)染后的適當(dāng)時(shí)間選用合適劑量的選擇培養(yǎng)基，篩選標(biāo)記基因表型，那些已導(dǎo)入外源基因的細(xì)胞將存活下來。
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