信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究方法ppt課件(參考版)
2025-05-15 06:26本頁面
【正文】 ? 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析和結(jié)構(gòu)測(cè)定 。 ? 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)胞及動(dòng)物水平進(jìn)行研究（蛋白表達(dá)，細(xì)胞定位，沉默或過表達(dá)對(duì)細(xì)胞功能的影響等） 。 ： （ 1） cAMP[3H]分析系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是放射性半衰期長(zhǎng)，可用于大量樣品的分析；（ 2） cAMP[125I]分析系統(tǒng)，用于小量樣品的分析；（ 3） cAMP ELISA測(cè)定方法，此方法簡(jiǎn)便、敏感。此外，還可以使用 Amersham公司生產(chǎn)的 DmyoIP3[3H]分析系統(tǒng)直接測(cè)定粗提物中的 IP3含量，此方法簡(jiǎn)易、敏感。常用的熒光探針有 quin2/Am、 Fura2/Am及 Indo1等，后二者較為敏感。 1.[Ca2+]的測(cè)定： 原子光譜法、離子微電極測(cè)定法、放射示蹤法及標(biāo)記示蹤法等。 轉(zhuǎn)基因載體 結(jié)構(gòu)基因 報(bào)告基因 增強(qiáng)子 啟動(dòng)子 受精 全能性細(xì)胞 注射 植入 假孕小鼠 后代 Southern blot RTPCR Western blot 轉(zhuǎn)基因小鼠 基因敲除技術(shù) Gene Knockout ? 體外合成無效基因或突變基因； ? 定向插入 (同源重組 )宿主細(xì)胞染色體 DNA中 取代相應(yīng)正?；?, 使特定目的基因在細(xì)胞內(nèi)或生物體內(nèi)失活； ? 應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法孵育出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 ,即為基因敲除動(dòng)物。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物： 以實(shí)驗(yàn)方法將外源基因?qū)雱?dòng)物染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。 甲醛處理使蛋白質(zhì)與染色質(zhì) DNA交聯(lián)； 超聲波或酶處理使染色質(zhì) DNA片段化； 抗體沉淀蛋白質(zhì) DNA交聯(lián)復(fù) 合體 （ IP） ； 消化蛋白 ， 解除交聯(lián) ， 純化 DNA； 檢測(cè)分析 (PCR, qPCR, Microarray) 6. 基因或蛋白質(zhì)功能研究 ? 改變基因結(jié)構(gòu) ? 基因突變（點(diǎn)突變、缺失、融合等） ? 將突變基因或蛋白引入細(xì)胞以檢測(cè)其功能 Dominant negative mutants (缺失結(jié)構(gòu)域突變體 ) (1) Ligandbinding site (2) Phosphorylation site (3) Docking site (4) Proteinprotein binding site (5) DNA binding site ? 基因表達(dá)或蛋白質(zhì)活性的抑制， 觀察表型變化推測(cè)基因功能 ? RNAi— use of small interfering RNA (siRNA) to reduce specific mRNA levels. ? Antisense oligonucleotides ? Ribozyme ? Monoclonal Antibody ? Small inhibitor molecules： tyrosine kinase inhibitor (TKi) ? 在生物整體內(nèi)改變基因表達(dá)或基因結(jié)構(gòu)（轉(zhuǎn)基因技術(shù)） ? transgenic ? Knockout RNA干擾技術(shù) RNA Interference (RNAi) 由雙鏈 RNA 所引起的序列特異性基因沉默 1. 長(zhǎng)雙鏈 RNA被細(xì)胞源性的雙鏈 RNA特異的 Ｄｉｃｅｒ核酸酶 切成２１～２３個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈 RNA，稱為小干擾RNA 2. 小干擾 RNA與細(xì)胞源性的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體 ，該復(fù)合體可識(shí)別與小干擾 RNA有同源序列的ｍ RNA，并在特異位點(diǎn)將該ｍ RNA切斷。因此，研究蛋白質(zhì)與 DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。 每產(chǎn)生一條 DNA鏈，就切斷一條探針，每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位信號(hào)， 信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的 DNA分子數(shù)成正比 。 ① ② TaqMan 探針 寡核苷酸探針的 5
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