【正文】 紫外檢測器 （三）熒光檢測器 (fluorescence detector； FD) ? 檢測原理： ?化合物受紫外光激發(fā)后 ， 發(fā)射出比激發(fā)光波長更長的光 ， 稱為熒光； ?熒光強度 (F) 與激發(fā)光強度 (I0) 及熒光物質(zhì)濃度 (C) 之間的關系為： F= Q為量子產(chǎn)率， K為熒光效率， ε為摩爾吸光系數(shù)，l為光徑長度。獲得三維光譜－色譜圖。 ? 局限： ?只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的截止波長應小于檢測波長。 有串聯(lián)式和并聯(lián)式 輸液系統(tǒng) 輸液泵應具備的性能： ? 流量精度高且穩(wěn)定 ? 流量范圍寬 ? 能在高壓下連續(xù)工作 ? 液缸容積小 ? 密封性能好，耐腐蝕 輸液系統(tǒng) 輸液泵操作注意事項： ? 防止固體微粒進入泵體 ? 流動相不應含有腐蝕性物質(zhì) ? 防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完 ? 不超過規(guī)定的最高壓力 ? 流動相一般應該先脫氣 二、分離和進樣系統(tǒng) ? 進樣器 ?進樣閥（六通閥）、自動進樣裝置 ? 色譜柱（ column） ?由柱管和固定相組成 ?分析柱、制備柱 ?性能評價 ?H、 n、 fs、 k和 α 的重復性，或 R。 HPLC中的速率理論 （二）正相鍵合相色譜法的分離條件 ? 固定相 ?極性鍵合相 如氰基、氨基鍵合相等 ? 流動相 ?烷烴加適量極性調(diào)節(jié)劑 （三）反相鍵合相色譜法的分離條件 ? 固定相 非極性鍵合相如 ODS ? 流動相 以水為基礎溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調(diào)節(jié)劑 ?弱酸、弱堿或緩沖鹽作為離子抑制劑 ?加入 %∽1% 的醋酸鹽、磷酸鹽可減少殘余硅醇基的作用 （四）反相離子對色譜法的分離條件 ? 固定相 盡可能選擇表面覆蓋度高且疏水性強的非極性鍵合相， ? 離子對試劑 離子對試劑所帶的電荷應與試樣離子的電荷相反 ? 流動相 pH 使試樣組分與離子對試劑全部離子化 ? 有機溶劑及其濃度 同一般 HPLC 第三節(jié) 高效液相色譜儀 ? 組成 ?輸液系統(tǒng) ?進樣系統(tǒng) ?色譜柱系統(tǒng) ?檢測系統(tǒng) ?數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 一、輸液系統(tǒng) ? 高壓輸液泵 ?恒流泵：在輸送流動相過程中流量恒定。 ?縱向擴散 β =2γ Dm 可以忽略。 ? （一）流動相對分離的影響 ? n由色譜柱（固定相）性能決定， ?α主要受溶劑種類的影響， ? k受溶劑配比的影響。 ?純度高，粘度小。使 k在 1~10范圍內(nèi)， ?與檢測器相適應。 鍵合相的性質(zhì)和特點 二、化學鍵合相色譜法的流動相 ? 對流動相的要求 ： ?與固定相不發(fā)生化學反應。 鍵合相的性質(zhì)和特點 ? 鍵合相的性質(zhì) ?含碳量：含碳的百分數(shù) ?覆蓋度 ：已反應的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例 ?封尾（ endcapping）：在鍵合反應后，用三甲基氯硅烷等進行鈍化處理，減少殘余硅醇基。 一、化學鍵合相色譜法的固定相 （一）鍵合相的種類 ? 非極性鍵合相 ： ?非極性烴基，如 C18﹑C 8﹑C 1與苯基等鍵合在硅膠表面； ?用于反相色譜； ?長鏈烷基可使溶質(zhì)的 k增大，選擇性改善，載樣量提高，穩(wěn)定性更好。 ?適用范圍：有機酸、堿、鹽，離子型和非離子型化合物的混合物。 ? 適用于 3≤p Ka≤7 的弱酸、 7≤p Ka≤8 的弱堿 反相鍵合相色譜法 ? 把離子對試劑加入到含水流動相中，組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子（ counter ion）生成 中性離子對 ，增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使 k增加，改善分離效果。 反相鍵合相色譜法 ? 保留行為的主要影響因素 ?流動相 極性越強，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的 k越大 ?溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強溶劑 ?溶劑比例：水的比例增加，使 k增大 ?中性鹽的加入：使中性溶質(zhì)的 k增大 ?pH：影響弱酸、弱減的離解 流動相的 pH降低，弱酸 k增大，tR增大；弱堿 k變小。 ?固定相 鍵合烷基的疏水性隨 碳鏈的延長 而增加，溶質(zhì)的 k也增大。 不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力， 反相鍵合相色譜法 ? 保留行為的主要影響因素 ?溶質(zhì)的分子結構（極性） 極性越弱，疏水性越強， k越大， tR也越大 。 （二）反相鍵合相色譜法 ? 固定相：非極性鍵合相 ? 如十八烷基硅烷（ C18， ODS）、辛烷基（ C8）鍵合硅膠 ? 流動相： 水 為基礎溶劑，加入一定量與水混溶的極性調(diào)整劑 ? 常用甲醇－水、乙腈－水等 應用：最廣。（與水不混溶的溶劑） ? 適用范圍：溶于有機溶劑的極性至中等極性的分子型化合物 ?如一些在硅膠柱上分離的物質(zhì) 正相鍵合相色譜法 ?分離機制？ ?分配：把有機鍵合層作為一個液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解 ?吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團間的誘導、氫鍵和定向作用 ? 分離選擇性： ?極性強的組分 k大，后洗脫出柱。 第一節(jié) 高效液相色譜法的主要類型和原理 ? 一、主要類型 四類基本類型色譜法 ?分配色譜法（ partition chromatography） ?吸附色譜法（ adsorption chromatography） ?離子交換色譜法（ IEC） ?空間排阻色譜法（ SEC） 第一節(jié) 高效液相色譜法的主要類型和原理 ?一、主要類型 四類基本類型色譜法 ?分配色譜法（ partition chromatography） ?吸附色譜法（ adsorption chromatography） ?離子交換色譜法（ IEC） ?空間排阻色譜法（ SEC） ?化學鍵合相色譜法 其他色譜類型 ?親合色譜法（ affinity chromatography； AC） ?手性色譜法（ chiral chromatography； CC） ?膠束色譜法（ micellar chromatography； MC） ?電色譜法（ electrochromatography；EC） 二、化學鍵合相色譜法 ? 以化學鍵合相為固定相的色譜法，簡稱 鍵合相色譜法 (bonded phase chromatography； BPC) ? 化學鍵合相：采用化學反應的方法將官能團鍵合在載體表面所形成的固定相 ?優(yōu)點： ?固定相的均一性和穩(wěn)定性好，在使用過程中不易流失，使用周期長； ?柱效高；重現(xiàn)性好； ?能使用的流動相和鍵合相的種類多，分離的選擇性高 正相（ normal phase， NP）和反相（ reversed phase， RP）鍵合相色譜法： 根據(jù)化學鍵合相與流動相極性的相對強弱 （一）正相鍵合相色譜法 ? 固定相：極性鍵合相 ?如氰基（－ CN）、氨基（－ NH2）或二羥基鍵合硅膠。紫外檢測器最小檢測限可達 10?9g，而熒光檢測器最小檢測限可達 10?12g。 （二）定量方法 ?內(nèi)標對比法（內(nèi)標一點法）： 標樣標樣）（）（iisisi//CCAAAA ?標標樣樣 ）（）（isisii // CAAAAC ??主要內(nèi)容 ? 固定液的分類和選擇 ? 檢測器的性能指標 ? 熱導、氫焰檢測器的原理和注意事項 ? 速率理論和實驗條件的選擇 ? 定量分析方法 第二十章高效液相色譜法 high performance liquid chromatography； HPLC 分析化學教研室 李發(fā)美教授 ? 經(jīng)典液相色譜法為基礎， ? 引入氣相色譜法的理論和實驗技術， ? 高壓輸送流動相， ? 高效固定相及高靈敏度檢測器， ? 現(xiàn)代液相色譜分析方法。 ?試樣液也加入與對照液相同量的內(nèi)標物，測得 Ai/As。 （二）定量方法 ?內(nèi)標校正曲線法：