【正文】 如果化合物溶液從中性變?yōu)閴A性時，吸收峰發(fā)生紅移，表明該化合物為酸性物質(zhì)；如果化合物溶液從中性變?yōu)樗嵝詴r，吸收峰發(fā)生藍(lán)移，表明化合物可能為芳胺。否則數(shù)據(jù)會丟失。 ，不要打開樣品室蓋。 ，各面均為光滑平面，使用時應(yīng)手持比色皿對角的棱，不要讓手碰到任何一面。 ，應(yīng)將光度計開關(guān)旁邊的氙燈開關(guān)撥到關(guān)的位置。 File菜單重選擇 Save，儲存獲得的數(shù)據(jù)。移動光標(biāo)至文本框，輸入注釋。 Start鍵開始收集數(shù)據(jù)。 ，點擊 Auto Zero設(shè)定零點。 4所示確定獲得參數(shù)。 ，點擊 OK鍵。 ，點擊 Read開始濃度的定量測定。 ， 可定量確定未知樣的濃度 。一旦獲得了足夠多的標(biāo)準(zhǔn)樣數(shù)據(jù)，在屏幕上便會 自動出現(xiàn)工作曲線 。輸入 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度值 并點擊 OK鍵。 ， 點擊 Auto Zero設(shè)定零點 。按圖 3所示進(jìn)行選擇。 定量分析 “ Acquire Mode”菜單中選擇 [Quantitative]，進(jìn)入 Quantitative模式，會自動顯示 Quantitative參數(shù)對話框。 Display刪除鼠標(biāo)所指區(qū)域。之后選擇 [Cross Hair]→[Display] ?；蛘邚暮?[Rader]的相同菜單中選擇 [Limit]（點擊鼠標(biāo)右鍵），設(shè)定新的圖形限制，在出現(xiàn)的對話框中輸入上限及下限。 ，會出現(xiàn)一個菜單，選擇 [Radar]，從副菜單中選擇 [Both Axes]，自動建立新的圖形限制。將光標(biāo)移至 Comment文本框，輸入注釋。 ，點擊 START開始掃描。 (2) 如果當(dāng)前模式已經(jīng)是 Spectrum模式，從“ Configure”菜單中選擇 [Parameters],可顯示 Spectrum Parameters對話框。 “ Acquire Mode”菜單中選擇 [Spectrum]進(jìn)入 Spectrum模式。 光譜 RF5301PC熒光分光光度計開關(guān)。 ，所有的數(shù)據(jù)要保存都必須點擊“ Save”或者“ Save As”進(jìn)行另存。 ，小心放入樣品，放入比色皿前一定要先用濾紙和擦鏡紙將比色皿外表面擦干凈，不要污染樣品池和光度計外表面。 六、注意事項 樣品池內(nèi)溶液 不要超過池容積的 4/5，樣品池放入樣品室前外部用軟紙擦干。 2．關(guān)閉 UV2550主機，關(guān)閉計算機、打印機、總電源。點擊菜單欄上的 [Print preview]鍵預(yù)覽，點擊菜單欄上的 [Print]鍵，輸出報告。完成后，取一個文件名并保存。點擊“ Start”再次掃描，若得出曲線值均小于 ，則認(rèn)為基線平坦，若數(shù)值較大，則將 800nm吸光度設(shè)為 0重新進(jìn)行基線掃描。 2．參數(shù)的設(shè)定：點擊菜單欄上的 [M]鍵，點擊［ Measurement］標(biāo)簽，根據(jù)提示在對話框中選擇波長測定范圍、掃描速度、采樣間隔等參數(shù)；點擊［ Instrument Parameters］標(biāo)簽，選擇測定種類（吸收值、透射能量、反射率）及通帶（狹縫）等條件。 （ 3）點擊 [Photometric]鍵進(jìn)入光度測定（定量）方式：可進(jìn)行多波長、單波長、峰高定量。） SHIMADZU UV2550型紫外可見分光光度儀操作規(guī)程 三、操作過程 1．在主菜單上選擇測定的方式： （ 1）點擊 [Kiics]鍵進(jìn)入動力學(xué)測定方式：一般測定吸收值隨時間的變化，通常用于酶反應(yīng)隨時間的變化。整個過程需花 4~5分鐘。 2．開啟計算機電源，雙擊桌面上的 UVProbe圖標(biāo)進(jìn)入操作系統(tǒng)。 2．確認(rèn)樣品室內(nèi)無樣品。 ? 應(yīng)用范圍不如吸收光譜法廣，因為有的分子不發(fā)熒光。 ? 選擇性好 ， 由于能發(fā)生熒光的化學(xué)體系不多 。 ? strand at pH , 52186。 ?Helix at pH , 25186。 紫外 /可見光譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用 ? 濃度測定 ? 構(gòu)象變化研究 ? 相互作用研究 蛋白質(zhì)主鏈的紫外吸收 ? 肽鍵在 250 nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)有較大吸收 蛋白質(zhì)濃度測定 ? ?190nm? 10000 l/ ? ?190nm比 ?280nm大 ~100倍 ? 但溶劑吸收也較大 溶劑的吸收 蛋白質(zhì)中氨基酸的紫外吸收光譜 1mM 二硫鍵在 250 nm附近有弱吸收 色氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸 確定蛋白質(zhì)的消光系數(shù) ? 可以根據(jù)蛋白質(zhì)序列預(yù)測蛋白質(zhì)的消光系數(shù) ProtParam: Tyr的吸收譜與 pH有關(guān) ? pH titration can be used to determine whether Tyr is internal or external polarity of environment ?max at pH 6: 274 nm ?max at pH 13: 295 nm 蛋白質(zhì)構(gòu)象變化研究 Absorption spectra of PolyLLys HCl: random coil at pH , 25186。溶劑分子與溶質(zhì)分子締合生成氫鍵時，對溶質(zhì)分子的 UV光譜有較大的影響。 3 定量分析 朗伯 比爾定律 朗伯 比爾定律是紫外 可見吸收光譜法進(jìn)行定量分析的理論基礎(chǔ)，它的數(shù)學(xué)表達(dá)式為 : A = ε l c 4 氫鍵強度的測定 溶劑分子與溶質(zhì)分子締合生成氫鍵時，對溶質(zhì)分子的 UV光譜有較大的影響。 標(biāo)標(biāo)樣 cAcX ?? A 比較法 標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在 λ最佳處分別測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度 A，然后以濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，在完全相同的條件下測定試液的吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得試液的濃度。如果有機化合物在紫外可見光區(qū)沒有明顯的吸收峰，而雜質(zhì)在紫外區(qū)有較強的吸收，則可利用紫外光譜檢驗化合物的純度。 ? 如果在 250～ 300nm有弱吸收帶則可能含有簡單的非共軛并含有 n電子的生色基團，如羰基等。 ? 如果在 260～ 300nm有中強吸收（ ε＝ 200～ 1 000），則表示體系中可能有苯環(huán)存在。 ? 如果在 210～ 250nm有強吸收，則可能含有兩個雙鍵的共軛體系，如共軛二烯或 α， β不飽和酮等。 ? 如果一個化合物在紫外區(qū)是透明的，則說明分子中不存在共軛體系，不含有醛基、酮基或溴和碘。