【正文】 PLysS含有表達 T7溶菌酶的基因，能夠降低目的基因的背景表達水平，但不干擾目的蛋白的表達，適合表達毒性和非毒性蛋白。T7噬菌體 RNA聚合酶位于 λ 噬菌體 DE3區(qū)，該區(qū)整合于 BL21的染色體上，適合表達非毒性蛋白。可用于藍(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。 平端切口 粘端切口 Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HincⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 1： DH5a菌株 DH5a是一種常用于質(zhì)粒克隆的菌株。羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基 限制性核酸內(nèi)切酶 定義： 限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease, RE)是 識別 DNA的特異序列 , 并在識別位點或其周圍切割雙鏈 DNA的一類內(nèi)切酶 。 常用于 cDNA第二鏈合成，雙鏈 DNA 3?末端標(biāo)記等 反轉(zhuǎn)錄酶 ① 合成 cDNA ② 替代 DNA聚合酶 I進行填補，標(biāo)記或 DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5180。羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個 DNA分子或片段連接 DNA聚合酶 Ⅰ ① 合成雙鏈 cDNA分子或片段連接 ② 缺口平移制作高比活探針 ③ DNA序列分析 ④ 填補 3180。 生物技術(shù)工程 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等 基因工程（ geic engineering） 實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程 目的 ① 分離獲得某一感興趣的基因或 DNA ② 獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)） 重組 DNA技術(shù)中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸內(nèi)切酶 識別特異序列，切割 DNA DNA連接酶 催化 DNA中相鄰的 5180。 獲取同一拷貝的過程稱為 克隆化 （ cloning） ，即 無性繁殖 。 缺點： DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降； 1500bp（雖無包裝限制，并非無限包裝）。 單鏈 DNA噬菌體載體 M1 f fd 優(yōu)越性： DNA噬菌體的復(fù)制，以雙鏈環(huán)形的 DNA為媒介，這種復(fù)制形式的 DNA簡稱 RFDNA； RFDNA還是 ssDNA都能感染大腸桿菌； DNA噬菌體顆粒的大小，是受其 DNA的制約的，不存在包裝限制問題，這一點正好與 λ 噬菌體相反。所以如果要同時分離ＤＮＡ分子中的雙鏈，則需要兩種獨立的克隆。這樣一來，為分別分離外源ＤＮＡ分子的兩條鏈帶來一定的麻煩，解決這一問題的的方法就是定向克隆技術(shù)。許多 M13載體的 MCS與質(zhì)粒載體 pUC序列的 MCS相同，在克隆位點選擇上更為方便。 M13載體 ? 這類載體主要用來獲得大量的單鏈ＤＮＡ片段，主要用來ＤＮＡ測序（ sanger雙脫氧法）、基因的定點突變、異源雙鏈 DNA的分析等。但是無論是 RF DNA或 ssDNA都能 轉(zhuǎn)染 F+或 F細(xì)胞。 M13噬菌體基因組可編碼 3類蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白（ Ⅱ ， Ⅴ 和 Ⅹ ），形態(tài)發(fā)生蛋白（ Ⅰ ， Ⅳ 和 Ⅺ ），結(jié)構(gòu)蛋白（ Ⅲ 、 Ⅵ 、 Ⅶ 、 Ⅷ 和 Ⅸ ）。較大的間隔位于基因 Ⅷ 和 Ⅲ 以及基因 Ⅱ 和 Ⅳ 之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達和 DNA 合成的元件。 重溶于 TE緩沖液中。將沉淀用 70%乙醇洗 12次。室溫放置 20分鐘。 甲酰胺抽提（更快捷溫和） 加 1/10體積的 2mol/L (pH )/ mol/L EDTA, 混勻后加入等體積的甲酰胺，混勻，室溫放置 30分鐘。低溫干燥。 離心 1,500 g 15分鐘，棄上清。共抽提三次。離心 5000r/min 10分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到干凈管中，加幾滴氯仿，混勻后放 4℃ 保存。 加幾滴氯仿裂解仍存在的菌體。然后轉(zhuǎn)移到 50毫升 NZC肉湯培養(yǎng)基（每升含 NZ胺 A 10克，氯化鈉 5克， 2克），置 37℃ 搖床培養(yǎng)。一般 68小時即可看到噬斑， 12小時后即可清楚地計數(shù)和挑選噬斑。整個過程要避免產(chǎn)生氣泡。 每管中加入 ，輕搖混合，然后小心地倒在 λ 肉湯平板上。將噬菌體溶菌液在 λ 肉湯培養(yǎng)基中 1： 1000連續(xù)稀釋，然后每個稀釋度取 毫升大腸桿菌的試管中，與大腸桿菌培養(yǎng)液混勻，在室溫孵育 20分鐘。在微波爐或沸水浴中溶化頂層瓊脂培養(yǎng)基，然后冷卻并維持在 4550℃ 水浴。使用前在水浴或微波爐溶化，然后冷卻至 4550℃，并維持在該溫度，可保持溶化狀態(tài)。 λ噬菌體的空斑試驗 培養(yǎng)基 λ 肉湯培養(yǎng)基： 每升含胰蛋白胨 10克，氯化鈉 ，高壓滅菌 15磅 30分鐘； λ 肉湯平板： 基本同上，每升加瓊脂 10克； λ 頂層培養(yǎng)基： 基本同上，每升加瓊脂 7克。 ? 以感染方式導(dǎo)入細(xì)胞的頻率可達 106108/μgDNA ，而以轉(zhuǎn)染方式導(dǎo)入的頻率僅為 103105/μgDNA 。 通過 cos位點相連成多聚體的 λDNA 逐漸進入噬菌體頭部，并在 cos位點處切開。 ? 體外包裝需要用 包裝提取物 ，即噬菌體感染大腸桿菌的溶菌液。 若不插入外源基因 溶源 混濁斑 若 CI插入外源基因 溶菌 透明噬斑 cI EcoR I LA λgt 10 lac Z LA EcoR I Charon 16A 插入式載體 Lac Z基因插入失活： 如 charon16A載體，在非必須區(qū)段引入 lac Z基因，在 lac Z基因上有 EcoR I位點，插入失活后利用 Xgal法篩選（蘭白篩選）。 插入式載體 cI基因插入失活： 如 λgt10 、 λNM1149 等載體，在 cI基因上有 EcoR I及 Hind III的酶切位點。 λ噬菌體載體 λ噬菌體載體的主要類型 一種只具有 一個 可供外源 DNA插入的克隆位點的載體。 天然 λ 僅可插入 3Kb外源 DNA片段，除去所有與 λ 裂解無關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入 22Kb。包裝后的噬菌體就是具有感染性的完整病毒顆粒，感染效率非常高。 λ噬菌體載體 Lytic phase (Replicate and release) Lysogenic phase (integrate into host genome) ● 外源 DNA插入載體 DNA后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，后者可感染宿主菌并大量復(fù)制。 λ 噬菌體基因組中部約占全長三分之一的區(qū)域是噬菌體復(fù)制的非必需區(qū)，外源 DNA替代這一區(qū)域不會影響噬菌體的復(fù)制。 只有雙鏈 DNA的噬菌體才具有溶源周期。 R （細(xì)胞裂解）、 λ 中部約 1/3的 DNA(b2)與 λ 存活無關(guān)。 R后早期激活后期tMP MP ECI阻 遏物溶源性建立和保持M L頭 尾Pi ? 一般結(jié)構(gòu)： 48,502bp，線狀dsDNA，兩端具有 12nt 5?突起，稱為 cos位點，被 λ 編碼的末端酶所識別，通過粘性末端的互補作用形成雙鏈環(huán)形 DNA。 轉(zhuǎn)化步驟 轉(zhuǎn)化結(jié)果分析 噬菌體 噬菌體概述 噬菌體概述 結(jié)構(gòu)：無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型 具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型 線狀體型 核酸類型：雙鏈線性 DNA 雙鏈環(huán)形 DNA 單鏈環(huán)形 DNA 單鏈線形 DNA 雙鏈 RNA 單鏈 RNA 分子量： 不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的 大分子量的噬菌體生命周期比較復(fù)雜，對寄主的依賴性較低 堿基組成： 有些噬菌體的 DNA堿基不是由標(biāo)準(zhǔn)的 A/T/C/G組成的 T4噬菌體 DNA沒有 C，取代的是 5羥甲基胞嘧啶（ HMC） SP01噬菌體 DNA中沒有 T，取代的是 5羥甲基尿嘧啶（ HMU） 噬菌體概述 噬菌體的一般生物特性 可脫離寄主細(xì)胞生存，但不能進行復(fù)制。 ● 各樣品培養(yǎng)液 ，分別接種于含抗菌素 LB平板培養(yǎng)基上，涂勻 。 ● 將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置 30min[（ 1）抑制細(xì)胞的旺盛生理代謝；（ 2）有助于DNACa2+吸附于細(xì)胞表面；（ 3）防止 DNAase降解 DNA]，于 42℃ 水浴中保溫 12min[使細(xì)胞攝入吸附于其表面的 DNA]，然后迅速冰上冷卻 2min。 ● 取 100181。通過宿主細(xì)胞的復(fù)制而使目的基因得到大量的擴增。 ? 原核細(xì)胞以大腸桿菌為主，真核細(xì)胞包括酵母及動物細(xì)胞等。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率； 6 ．質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是 超螺旋的 DNA； 7 ．一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA的濃度呈正比； 轉(zhuǎn)化（ transformation） ? 重組分子導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞的過程就是轉(zhuǎn)化。 感受態(tài)宿主菌的制備 電轉(zhuǎn)化法 感受態(tài)宿主菌的制備 注意事項 1．細(xì)菌的生長狀態(tài)：實驗中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用 對數(shù)生長期的細(xì)胞（一般通過檢測 OD600來控制。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺和冰上操作； 4．吸取 ，在冰上冷卻 10分鐘； 5． 4℃ 下 3000g冷凍離心 5分鐘； 6．棄去上清，加入 1500?l冰冷的 10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??； 7． 4℃ 下 3000g冷凍離心 5分鐘 8．棄去上清，加入 750?l冰冷的 10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??； 9． 4℃ 下 3000g冷凍離心 5分鐘 10．加入 20?l冰冷 10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮； 11．立即使用或迅速置于 70186。 ? 置冰上預(yù)冷 10分鐘，然后 4℃ 、 5000rpm離心 10分鐘，棄上清； ? 以 10ml冰預(yù)冷的 ，放置于冰浴中 20分鐘； ? 4℃ 、 5000rpm離心 10min，棄上清； ? 按每 50ml培養(yǎng)物加入 2ml冰預(yù)冷的 ，再