【正文】 細(xì)胞群體的形態(tài)學(xué)特征或一些特別的生化特征應(yīng)在菌種保藏前后保持同一性 ， 以及實驗室中 、 中試車間中和生產(chǎn)發(fā)酵中產(chǎn)品滴度的穩(wěn)定性 ， 后者極為重要 。 在一給定溫度下通過對高溫下短期活力喪失程度檢測 ， 可以用來預(yù)測嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定性 。 ? 對工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來說 ， 建議保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征 (如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生 、 酶活力 、遺傳特征及生化指標(biāo) )應(yīng)在保藏后加以檢測和確定 。 微生物活力和穩(wěn)定性測定 ? 所有保藏菌種的方法都必須是長期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變 。 而且在運用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時 ， 抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào) 。 ?一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時 ， 生長速度會加快 。 基因工程菌的保藏 ?由載體質(zhì)粒等攜帶的外源 DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的 、 且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子 。 所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏 。 ?以液體石蠟作為保藏方法時 ， 應(yīng)對需保藏的菌株預(yù)先作試驗 。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效 。 二、礦物油中浸沒保藏 ?將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏 ， 此方法簡便有效 。 ? 斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于 5℃ 保藏 ， 以防止培養(yǎng)基脫水并能降低代謝活性 。 ?但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯 、 菌體自溶 、 基因突變 。 ?可用于實驗室中若干菌種的保藏 。 (4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀 ， 可以將此直接振落入盛有 l～ 2ml液體培養(yǎng)基的試管中 ， 輕輕振蕩 5～ l0min， 然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基 。 (2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿 ， 然后用手掰開安瓿 ． (3)在安瓿中加入 ～ 1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基 ， 慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿 ， 使凍干菌種復(fù)水 。 較低的保藏溫度 (20～ 70℃ )對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好 。 14． 關(guān)閉冷凝器 。 11． 干燥后 ， 在 ～ ． 12． 在所有安瓿都封蓋好后 ， 撤去真空 。 8． 關(guān)掉可調(diào)溫控裝置的降溫探頭 ， 讓醇浴溫度上升至室溫 (25℃ )． 9． 在冷凍干燥的最初 4h內(nèi)應(yīng)定期測真空度 ， 在安瓿置于真空下后 1h內(nèi) ， 真空度必須達(dá)到 ， 并于菌懸液接近干燥時逐漸降到 ～ 。 7． 維持 40℃ 的醇浴溫度 90120min， 然后調(diào)節(jié)溫控裝置 。 使細(xì)胞懸液迅速凍結(jié) 。 5． 輕輕振蕩安瓿 ， 以使細(xì)胞重新懸浮 。 3． 每支斜面加入 2ml 20％ 的脫脂乳 ， 然后用巴氏吸管將斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌體均懸液 ， 最終菌株濃度一般要求在 106CFU／ m1． 用細(xì)菌浸沒培養(yǎng)物來保藏時 ， 加入 40％ 的脫脂乳 ， 混合制成含 106CFU／ ml的均懸液 。 2． 將冷凍槽置于歧管之下方 。 (二 )操作步驟 1． 啟動冷凍干燥器的致冷單元 。 ? 大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏 10年之久而不喪失活力 。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一 。 (三 )復(fù)蘇 1． 從液氮罐中取出所需的安瓿 ， 立即置于冰浴中； 2． 迅速將安瓿置于 3740℃ 水浴中 ， 并輕輕搖動以加速解； 3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有 2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取 (約 8滴 )轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。 2． 控速冷凍 ． (1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中 ， 然后置于一較大的金屬容器中； (2)將此金屬容器置于控速冷凍機的冷凍室中； (3)以 12℃ /min的致冷速度降溫 ， 直到溫度達(dá)到相對溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點 (通常為 30℃ )； (4)補加一定量的液氮至系統(tǒng)中 ， 使細(xì)胞在凍結(jié)點時盡可能快地發(fā)生相變； (5)細(xì)胞凍結(jié)后 ， 將致冷速度降為 1℃ /min， 直到溫度達(dá) 50℃ ； (6)將安瓿迅速移入液氮罐中于氣相 (96℃ )或 液相(156℃ )中保存 。 所使用的甘油 — 般用高壓蒸汽滅菌 ， 而二甲亞砜最好為過濾滅菌 。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏 5年而活力不受影響。 ? ? 如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含 10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。 二、超低溫冷凍保藏技術(shù) (60一 80℃) ?要求長期保藏的微生物菌種 ， 一般都要求在 60℃ 以下進(jìn)行保藏 。 ? 保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度 ， 培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封 。 ?用此方法可以維持若干微生物的活力 1— 2年 。 冷凍保藏種類 一 、 普通冷凍保藏技術(shù) (20℃ ) 二 、 超低溫冷凍保藏技術(shù) (60一 80℃ ) 三 、 液氮冷凍保藏技術(shù) 普通冷凍保藏技術(shù) (20℃) ?將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉 ， 然后貯藏于一冰箱的冷藏室中 ， 或于溫度范圍在 5～ 20℃ 的普通冰箱 (20℃ )中 。冷凍保藏時溫度要求在 20℃ 以下 ， 同時應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變 。 一般而言 ，冷凍溫度愈低 ， 效果愈好 。 冷凍保藏 ?冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法 。 (3)菌種保藏的基本措施是低溫 、 干燥 、 真空 。 工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) ? 在生產(chǎn)發(fā)酵中 ， 具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟價值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長期保藏 ， 對于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要 。 ? 將它們轉(zhuǎn)接入含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中時，變異株能迅速利用誘導(dǎo)底物進(jìn)行生長繁殖，而誘導(dǎo)型出發(fā)菌株需經(jīng)歷一個誘導(dǎo)合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步，組成酶變異株所占的比例將逐漸增大。 ? 2) 循環(huán)培養(yǎng)法：利用不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。 ? 為了提高組成酶變異株的優(yōu)勢，即它在群體中的比例，可以應(yīng)用恒化器培養(yǎng)技術(shù)。 ? 1) 恒化器法：常被用于微生物的 “ 馴化 ” 。 ? 組成酶變異株的篩選 許多水解酶是誘導(dǎo)酶，只有在含有底物或底物類似物的培養(yǎng)環(huán)境中，微生物才會合成這些酶類，所以，誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)不僅需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。抗性突變株的篩選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段。營養(yǎng)缺陷型的篩選一般包括濃縮、進(jìn)一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。 初篩的搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株只做一次發(fā)酵測定，從大量菌株中選出 1020%較好的菌株，淘汰 8090%的菌株；而復(fù)篩中搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株培養(yǎng) 3瓶，選出35個較好的菌株，再做進(jìn)一步比較，選出最佳的菌株 。 ? 復(fù)篩的目的是確認(rèn)符合生產(chǎn)要求的菌株，所以，復(fù)篩步驟以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次。 ? 為了花費最少的工作量，在最短的時間內(nèi)取得最大的篩選成效，就要求采用效率較高的科學(xué)篩選方案和手段。 ? 如果是新的代謝產(chǎn)物 ． 一般要進(jìn)一步確定其化學(xué)結(jié)構(gòu) ， 井在此基礎(chǔ)上進(jìn)行合成法的研究或進(jìn)行化學(xué)改造 ， 研究結(jié)構(gòu)與生物活性的相互關(guān)系 ，并對作用機制 、 生物合成過程作進(jìn)一步的研究 。 化學(xué)的早期鑒別一般對產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行紙上層析 、 薄板層析 、 紙上電泳 、 抗茵譜 、 高壓電泳 、 紫外分光光度法 、 液相和氣相色譜等試驗 ， 井獲得各種圖譜 ， 與已知圖譜進(jìn)行比較鑒別 。 性能簽別 ? 性能鑒別是分離和篩選微生物代謝產(chǎn)物中最基礎(chǔ)的工作 。 通過預(yù)篩選 ， 直接測定最初分離物的生物活性 ， 能加速篩選過程 。 ? (二 )間接方法 ? 篩選醫(yī)用抗生素 ， 可用細(xì)茵 、 真菌 、 病毒或腫瘤模型 ， 尋找抗細(xì)菌 、 抗真菌 、 抗病毒 、 抗腫瘤抗生素 、 酶抑制劑 、 免疫制劑等有效物質(zhì) 。 四、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法 ? (一 )直接方法 ? 為了盡快確定微生物代謝產(chǎn)物的利用前途 ， 在體外試驗測得活性后 ， 可以將培養(yǎng)液的有效成分直接作用于機體 ， 觀察被測樣品的療效 。 ? (5)DNA重組技術(shù)。 ? (3)利用微生物轉(zhuǎn)化改造代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。 篩選新的代謝產(chǎn)物 一、開發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑 ? (1)從自然界分離新的微生物菌株，或采用新的檢閱方法篩選新的代謝產(chǎn)物。 另外 ， 最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化 。 2． 菌體的培養(yǎng)時間 為了使細(xì)胞易于原生質(zhì)體化 ， 一般選擇增殖期的菌體 。 影響原生質(zhì)體制備的因素 1． 菌體的前處理 為了使酶作用的效果好一些 ， 可將菌作一些前處理 。 (二 )原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細(xì)胞壁分解酶 ， 將細(xì)胞壁分離剝離 ， 結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細(xì)胞 ， 它保持原細(xì)胞的一切活性 。 采用抗藥性菌株除可作標(biāo)記外 ， 在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾 。 三、原生質(zhì)體融合育種的要點 （ 一 ） 標(biāo)記菌種的選擇 獲得標(biāo)記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種 ， 篩選出營養(yǎng)缺陷型或／和抗藥性菌株 。 5． 選擇性培養(yǎng)基上劃線生長 ， 分離驗證 ， 挑取融合子進(jìn)一步試驗 、 保藏 。 3． 等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合 。 二、原生質(zhì)體融合育種步驟 1． 標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證 。 (六 )提高菌株產(chǎn)量的潛力較大 。 (四 )存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性 。 (二 )受接合型或致育型的限制較小：二親株中任何一株都可能起受體或供體的作用 ， 因此有利于不同種屬間微生物的雜交 。 ? 原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是 1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會上提出來的 。 原生質(zhì)體育種 ? 原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合 、 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù) ， 此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等 。 ? 酵母的雜交方法有孢子雜交法 、 群體交配法 、 單倍體細(xì)胞雜交法和罕見交配法 。 ? 在生活過程中 ， 酵母細(xì)胞還可以形成三倍體 、 四倍體 、 多倍體或非整倍體細(xì)胞 。 ? 單倍體細(xì)胞具 α 及 ε 2兩種交配型 。 ? F因子有明顯的感染性 ， 大腸桿菌的接合 ， 實質(zhì)上是 F因子的轉(zhuǎn)移 ， 所以 F+和 Hfr稱供體菌 ， 而 F稱受體菌 。 ? 大腸桿菌中存著致育因子 F， 有 F因子為 F+， 沒有 F因子稱 F。 ? 四 、 內(nèi)切酶圖譜鑒定 ? 經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落 ， 小量培養(yǎng)后 ， 再分離出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體 DNA， 用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割 ， 釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子 ， 還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向 。 ? 而重組子由于基因插入使 α －肽基因失活 ， 不能形成 α －互補 ， 在含 Xgal的平板上 ， 含陽性重組子的細(xì)菌為無色菌落或噬菌斑 。 二、 β －半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選 ? 很多載體都攜帶一段細(xì)菌的 lacZ基因 ， 它編碼β －半乳糖苷酶 N端的 146個氨基酸 ， 稱為 α －肽 ， 它表達(dá) β －半乳糖苷酶的 C端肽鏈 。 一、抗藥性標(biāo)志的篩選 ? 如果克隆載體帶有某種抗藥性標(biāo)志基因如 ampr或 tetr ， 轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落 ，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來 。 ? 通過細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴增 ， 獲得所需的基因片段的大量拷貝 。 但習(xí)慣上常把以噬菌體 DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染 。 一種是感染 ， 即在體外將噬菌體 DNA包裝成病毒顆粒 ， 然后使其感染受體菌 。 ? 此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌 ， 它的優(yōu)點是操作簡便 、 轉(zhuǎn)化效率高 、 適用于任何菌株 。 一、轉(zhuǎn) 化 ? 指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體 ， 將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程 。 重組 DNA導(dǎo)入宿主菌 ? 體外連接的重組 DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中