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病原生物學(xué)實(shí)習(xí)指導(dǎo)(參考版)

2025-04-10 03:57本頁(yè)面
  

【正文】 接種用器材(。動(dòng)物的排泄物及使用的籠罐等必須嚴(yán)格消毒,任何用過(guò)的動(dòng)物,不宜再做其它試驗(yàn)。 ⑥接種后的動(dòng)物應(yīng)每天觀察l一2次,注意動(dòng)物的精神狀態(tài)、活動(dòng)能力,飲食和大小便情況、體溫、注射部位的反應(yīng)以及全身反應(yīng),如不安、聳毛、震顫、弓背、麻痹及死亡等,并應(yīng)詳細(xì)記錄之。 ⑨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)做好標(biāo)記,對(duì)較大動(dòng)物如家兔、豚鼠等可用金屬號(hào)碼牌固定于耳朵上,對(duì)較小動(dòng)物如大白鼠、小白鼠等可用復(fù)紅(紅色)和苦味酸(黃色)等染料涂于身體的不同部位,以資識(shí)別。 ③實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要精心飼養(yǎng)、喂以適當(dāng)?shù)娘暳?,并給以充足的飲水。購(gòu)買的動(dòng)物,一般至少要隔離觀察10天,證明無(wú)隱性傳染病方可使用。 1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理 ④實(shí)驗(yàn)室常用的動(dòng)物有家兔、豚鼠(荷蘭豬)、小白鼠、大白鼠、地鼠、綿羊、雞等,根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的,選擇最適宜的動(dòng)物。將上述涂片行革蘭氏染色,鏡檢,與接種的懸液涂片進(jìn)行對(duì)比,并分析結(jié)果。觀察腹腔有無(wú)積液,觀察腹部各臟器的狀態(tài),特別是肝、脾的狀態(tài),剪取臟器組織塊進(jìn)行涂片。無(wú)菌操作剪開心臟并用接種環(huán)沾取心血進(jìn)行涂片,同時(shí)剪取肺組織塊進(jìn)行涂片。圖4—3 小白鼠的固定菽皮映切開法 用鑷子把持劍突,由劍突下部開始用剪刀剪斷兩側(cè)肋骨與肋軟骨結(jié)合部位,向上翻轉(zhuǎn)揭開胸壁。如圖4—3所示,首先沿正中線由恥骨剪至下腭部,再向四肢剪開皮膚。用碘酒棉球消毒胸腹部皮膚。解剖前一切解剖用具(如剪子、鑷子等)應(yīng)煮沸10分鐘消毒,并備一酒精瓶以便將解剖用具隨時(shí)沽取酒精,點(diǎn)燃消毒。逐日觀察,記錄觀察結(jié)果。 將小白鼠用染料涂抹做好標(biāo)記,放入動(dòng)物罐中。 圖4—1小白鼠的抓取 圖4—2小白鼠的固定和腹腔內(nèi)注射 4. 以無(wú)菌鑷子取碘酒棉球,消毒小白鼠左下腹部,用鑷子取下注射器針頭上的棉花紙包,放入消毒罐中。 2. 用消毒好的注射器,按無(wú)菌操作法抽取菌懸液后,再用無(wú)菌鑷子夾一滅菌棉花紙包,將針頭刺入棉花紙包內(nèi),排出注射器內(nèi)的氣體,然后將注射器平置于試管架上?!静牧稀竣傩“资螈诟腥痉窝浊蚓男“资笈K器研磨懸液③肺炎球菌血平板培養(yǎng)物制作的懸液④革蘭氏染色液⑤動(dòng)物解剖用具(一套),注射器、滅菌棉花紙包、碘酒棉球、酒精罐。此試驗(yàn)可用于區(qū)分金黃色葡萄球菌和表皮及腐生葡萄球菌。 【方法】 將被檢菌12—18h培養(yǎng)物置沸水中煮沸15min,冷卻后,吸取此培養(yǎng)物1~2滴,%DNA瓊脂平板表面,37℃孵育18~24h,然后用1MHC1傾注平板,觀察結(jié)果。故于DNA瓊脂板上加入鹽酸,可在產(chǎn)生耐熱DNA酶的部位形成透明圈。實(shí)驗(yàn)4 細(xì)菌耐熱核酸酶試驗(yàn) 【原理】 金黃色葡葡萄球菌能產(chǎn)生一種耐熱核酸酶,它需Ca2+作為激活劑,對(duì)熱有顯著的抵抗力(100℃15分鐘),而任何其它來(lái)源的DNA酶均不具有這種耐熱的性質(zhì)。此試驗(yàn)不宜用血平板上的菌落,因紅細(xì)胞內(nèi)含有此酶,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性?!窘Y(jié)果判定】 于半分鐘內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性,不產(chǎn)生氣泡者為陰性。實(shí)驗(yàn)3 細(xì)菌的觸酶試驗(yàn)【材料】 3%過(guò)氧化氫水溶液(新鮮配制),載玻片。 (二)試管法 吸取1:4稀釋的兔血漿放于二支滅菌小試管中,用滅菌接種環(huán)沾取葡萄球菌培養(yǎng)物一滿環(huán),在一小試管內(nèi)壁徐徐研磨使成均勻懸液。 (一)玻片法 在載物片兩端各滴鹽水一滴,取葡萄球菌平板培養(yǎng)物放生理鹽水中混成均勻菌液,在其中一端的菌液中加兔血漿一滴搖勻,立即觀察結(jié)果,如血漿中有明顯小凝塊出現(xiàn),而生理鹽水中無(wú)此現(xiàn)象者為陽(yáng)性,若血漿中無(wú)凝塊時(shí)為陰性。肺炎球菌可被膽鹽溶解液體變?yōu)橥该鳎仔腿苎枣溓蚓槐蝗芙?,液體仍呈混濁狀態(tài).實(shí)驗(yàn)2 細(xì)菌血漿凝固酶試驗(yàn) 致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶,可凝固新鮮的人血漿或兔血漿。然后,其中一支加10%()。6.膽汁(膽鹽)溶解試驗(yàn) 肺炎球菌能被膽汁或膽鹽溶解,甲型溶血性鏈球菌則不能,故可用做二者的鑒別。另一試管做為對(duì)照,將二試管放在37℃水浴箱中,每半小時(shí)觀察一次結(jié)果,觀察至4h。此法較簡(jiǎn)便,但不如試管法銳敏、準(zhǔn)確。檢測(cè)此種酶的試驗(yàn),常用于鑒定葡萄球菌的致病力,以區(qū)別非致病性葡萄球菌。 若呈草綠色溶血時(shí),為甲型溶血性鏈球菌,但應(yīng)做膽汁(膽鹽)溶解試驗(yàn)和菊糖發(fā)酵試驗(yàn)與肺炎球菌相鑒別。然后再經(jīng)純種移植,做血漿凝固酶試驗(yàn)和甘露醇發(fā)酵試驗(yàn),確定其致病力。將菌落的剩余部分移種于普通瓊脂(或血液瓊脂)斜面上,以便獲得大量純種細(xì)菌做進(jìn)一步的檢查。 3.染色鏡檢 將膿汁直接涂片用革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)、排列及染色性,在涂片上通??梢?jiàn)到革蘭氏陽(yáng)性暗紫色的球菌散在于薔薇色的白細(xì)胞之間或其中。 ⑤對(duì)可疑為敗血癥的病人,按無(wú)菌操作采血5ml,立即注入葡萄糖肉湯培養(yǎng)基內(nèi)增菌,12~18h后再作分離培養(yǎng)。 ③采取膿腫處的膿汁,如懷疑有厭氧菌,最好用注射器抽取膿汁立即送檢。 【方法】 1.標(biāo)本采集 ①一般用無(wú)菌棉棒(拭子)采取膿汁及病灶分泌物。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)膿汁病原菌檢查這一系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程,初步掌握化膿性球菌的檢查程序和鑒定方法。當(dāng)抑菌橢圓環(huán)伸至試條下方時(shí),即環(huán)的邊緣與試條無(wú)交點(diǎn)時(shí),MIC應(yīng)報(bào)告為小于讀數(shù)刻度的最低值?!窘Y(jié)果】 達(dá)到要求的孵育時(shí)間且細(xì)菌的生長(zhǎng)清晰可辨時(shí)(圖3—8),即可在橢圓抑菌環(huán)與E試條的交界處讀取MIC值。一旦放好,切勿再移動(dòng)試條,因?yàn)榭股卦谒查g已擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂。必要時(shí),可用鑷子輕壓試條以驅(qū)趕其下方的氣泡,并且總是從濃度最小端向上驅(qū)氣泡。使用模板墊在平板下來(lái)準(zhǔn)確定位試條所在平板的位置。停放10~15min讓瓊脂表面菌液吸收,以保證加試條前瓊脂表面完全干燥。對(duì)非常敏感菌株,每平板的試條數(shù)應(yīng)減少些。4.制作用于E實(shí)驗(yàn)的加樣模板:用如圖3—7A所示的模板墊襯;可將4~6個(gè)不同藥物E試條放到150mm平板上。所需培養(yǎng)基與添加物隨受試菌不同各異。;厭氧菌在制備過(guò)程當(dāng)中極易死亡,要用1號(hào)麥?zhǔn)蠞岫取E圓環(huán)邊緣與試條的交界處刻度(以μg/ml為單位)即為MIC值。 當(dāng)E試條被放置在一個(gè)已接種細(xì)菌的瓊脂平板上時(shí),其載體上的抗生素迅速且有效地釋放入瓊脂介質(zhì),從而在試條下方馬上建立了一個(gè)抗生素濃度的連續(xù)的指數(shù)梯度。 根據(jù)不同的抗生素,~32μg/~256μg/~1024μg/ml的連續(xù)濃度范圍。試條的一面標(biāo)有以μg/ml為單位的MIC判讀刻度。盡管E試驗(yàn)的操作與紙片擴(kuò)散法相似,但它又不同于常規(guī)紙片法,表現(xiàn)在預(yù)先形成的穩(wěn)定的抗生素濃度梯度的使用。E試驗(yàn)?zāi)苡眠B續(xù)的MIC數(shù)值直接對(duì)抗生素的藥敏定量。判定時(shí)應(yīng)注意:①薄霧狀生長(zhǎng)不算;②<5個(gè)菌落不算;③若在數(shù)個(gè)平板上呈拖尾或跳管生長(zhǎng)等現(xiàn)象,應(yīng)該重做。結(jié)果可用藥物的濃度報(bào)告。 2.取已校正濃度的待檢菌液(108CFU/ml)接種于含藥瓊脂的表面,操作時(shí)從最低濃度的瓊脂種起,使每滴約2μl菌液,每一接種點(diǎn)的液滴直徑為5~8mm,注意勿使移動(dòng),待接種點(diǎn)干燥后,再將平板翻轉(zhuǎn),置35℃孵箱內(nèi)孵育16~24h觀察結(jié)果。 【材料】 1.菌種:金黃色葡萄球菌菌液(108CFU/ml) 2.培養(yǎng)基:水解酪蛋白(MHA)培養(yǎng)基(MH肉湯1000ml,調(diào)pH值后,加17g瓊脂,分裝后15磅/英寸2高壓滅菌l5min備用) 3.抗菌藥物原液(1280μg/ml) 4.麥?zhǔn)媳葷峁?,校正待檢菌濃度用。(三)瓊脂稀釋法 【原理】 瓊脂稀釋法敏感試驗(yàn)是將不同劑量的抗菌藥物,分別加入融化并冷至45℃的定量瓊脂培養(yǎng)基中,混勻,制成無(wú)菌平板,即為所含藥物濃度遞減的培養(yǎng)基。3.將各管中加入已校正濃度的金黃色葡萄球菌菌液(105cfu/ml),混勻后放置35℃培養(yǎng)18h,觀察結(jié)果。 3.100u/ml的青霉素鉀鹽 【方法】 1.取無(wú)菌小試管10支排于試管架,2—10管各加1ml。 2.培養(yǎng)基:MH肉湯,去脂肪筋膜牛肉300g絞碎,加蒸餾水1000ml,制成肉浸液。(二)試管稀釋法 【原理】 以水解酪蛋白(MH)液體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋,然后接種入待檢細(xì)菌,定量測(cè)定抗菌藥物抑制或殺死該菌的最低抑菌濃度(MIC)或最低殺菌濃度(MBC)。一般抑菌環(huán)直徑在15mm以上者為高度敏感,10~15mm為中度敏感,10mm以下為低度敏感,無(wú)抑菌環(huán)者為耐藥。最終判斷細(xì)菌對(duì)每種抗菌藥物的敏感程度,記錄和報(bào)告結(jié)果。 3.做好標(biāo)記,放37℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜(不超過(guò)17h)。 【材料】 ① 普通瓊脂平板培養(yǎng)基 ② 金黃色葡萄球菌分離培養(yǎng)物 ③ 大腸桿菌分離培養(yǎng)物 ④ 藥物紙片 ⑤ 酒精 ⑥ 鑷子 【方法】 1.按無(wú)菌操作法用接種環(huán)從分離培養(yǎng)平板上已選好的菌落沾取細(xì)菌,反復(fù)交叉密涂于平板培養(yǎng)基上,以便生長(zhǎng)出均勻的菌苔(注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基)。測(cè)量抑菌環(huán)的大小,即可判定該細(xì)菌對(duì)某種藥物的敏感程度。其原理是將干燥的浸有一定濃度抗菌藥物的濾紙片放在已接種一定量某種細(xì)菌的瓊脂平板上。 結(jié)果:紫外燈管直接照射處無(wú)菌生長(zhǎng),如用玻璃和黑紙遮蓋,則有菌生長(zhǎng)。紫外線殺菌力強(qiáng)而穩(wěn)定,但穿透力弱,不能透過(guò)普通玻璃和有色紙張,因此,只適用于直接照射的物體表面消毒或空氣消毒。常用的是水銀燈,燈管由石英玻璃制成,管內(nèi)充滿壓強(qiáng)為266Pa的氬和幾滴水銀。(四)紫外線燈的使用 紫外線中波長(zhǎng)為240~280nm者具有殺菌能力,其中265~266nm的殺菌作用最強(qiáng)。濾器經(jīng)高壓滅菌后,洗凈備用。將待濾液體倒入濾菌器內(nèi),開動(dòng)抽氣機(jī)使濾瓶中壓力減低,濾液則徐徐流入濾瓶中。 2.用法:將清潔的濾菌器(賽氏濾菌器和薄膜濾菌器須先將石棉板或?yàn)V菌薄膜放好,擰牢螺旋)和濾瓶分別用紙或布包裝好,用高壓蒸汽滅菌器滅菌。濾菌器薄膜采用優(yōu)質(zhì)纖維濾紙,用一定工藝加壓制成。~250μm不等,分為GGGGGG6六種規(guī)格,后兩種規(guī)格均能阻擋細(xì)菌通過(guò)。 ②玻璃濾菌器(圖3—3):由玻璃制成。上部的金屬圓筒,用以盛裝將要濾過(guò)的液體;下部的金屬托盤及漏斗,用以接受濾出的液體;上下兩部分中間放石棉濾板,濾板按孔徑大小可分為三種:K濾孔最大,供澄清液體之用;EK濾孔較小,供濾過(guò)除菌;EK—S濾孔更小,可阻止一部分較大的病毒通過(guò)。下面介紹幾種常用的濾菌器。種類很多,孔徑非常小,能阻擋細(xì)菌通過(guò)。一般吸管、試管、培養(yǎng)皿、凡士林、液體石蠟等均可用本法滅菌。 2.用法:將培養(yǎng)皿、吸管、試管等玻璃器材包裝后放入箱內(nèi),閉門加熱。箱前有鐵門及玻璃門,箱內(nèi)有金屬箱板架數(shù)層。箱底下放置大型火爐,或在箱壁中裝置電熱線圈。目前已出現(xiàn)全自動(dòng)電熱高壓蒸汽滅菌器,操作簡(jiǎn)單,使用安全。高壓蒸汽滅菌法為濕熱滅菌法,其優(yōu)點(diǎn)有三:一濕熱滅菌時(shí)菌體蛋白容易變性,二濕熱穿透力強(qiáng),三蒸氣變成水時(shí)可放出大量熱增強(qiáng)殺菌效果,因此,它是效果最好的滅菌方法。滅菌時(shí)間到達(dá)后,停止加熱,待壓力降至零時(shí),慢慢打開排氣閥,排除余氣,開蓋取物。待冷空氣全部排出后(即水蒸氣從排氣閥中連續(xù)排出時(shí)),關(guān)閉排氣閥。蓋上滅菌器蓋,擰緊螺旋使之密閉。滅菌器內(nèi)裝有帶孔的金屬擱板,用以放置要滅菌物體(圖3—1)。高壓蒸汽滅菌器上裝有排氣閥門、安全活塞,以調(diào)節(jié)蒸汽壓力。這里主要介紹物理因素殺滅微生物的幾種方法,以及相關(guān)器材的使用。 (劉 兵) 第三章 消毒滅菌和藥物敏感性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1 常用消毒滅菌除菌器的使用 微生物廣泛存在于周圍環(huán)境中,其中有些又是病原微生物,從預(yù)防感染出發(fā),醫(yī)務(wù)工作者必須嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作,對(duì)所用的物品和工作環(huán)境進(jìn)行消毒滅菌,確保醫(yī)療與科研正常進(jìn)行。 — 不形成凝膠。 【結(jié)果觀察】 十十 形成牢固凝膠,倒持安瓶凝膠不動(dòng)。 2.向①、②、③安瓶中分別加待測(cè)物、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素、。 4.1ml無(wú)菌吸管、37℃水浴箱等。 2.待測(cè)物(血液、細(xì)菌培養(yǎng)上清液或注射劑等)。鱟試驗(yàn)具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。鱟試驗(yàn)可測(cè)出微量?jī)?nèi)毒素(~/ml)。實(shí)驗(yàn)4 內(nèi)毒素的檢測(cè)(鱟試驗(yàn))腸道桿菌多為革蘭氏陰性桿菌,具有內(nèi)毒素,若引起敗血癥、腦膜炎等感染時(shí),可用血液、腦脊液及體液等檢測(cè)內(nèi)毒素,以協(xié)助臨床診斷?,F(xiàn)在多種微量、快速、半自動(dòng)或全自動(dòng)的細(xì)菌生化反應(yīng)試劑盒和檢測(cè)儀器已廣泛應(yīng)用于臨床。 4.尿素分解試驗(yàn)(Splitting of urea)將細(xì)菌接種于尿素培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)18~24h。有些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸,生成硫化氫,穿刺部位呈黑褐色,是為反應(yīng)陽(yáng)性。大腸桿菌則不能分解枸櫞酸鹽,培養(yǎng)基顏色不變,為陰性。 ④ 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(Utilization of citrate) 將細(xì)菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)48h。 ③ VP試驗(yàn)(VogesProskauer test) 將細(xì)菌接種于葡萄糖蛋白胨水中,37℃培養(yǎng)48h后,再向培養(yǎng)基中加入等量的40%氫氧化鉀溶液(%肌酸)。 注:甲基紅試劑:,溶于60%的酒精100ml中。大腸桿菌等細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,但丙酮酸不被縮合成乙酰甲基甲醇,培養(yǎng)基中酸多,pH值低,故呈紅色,為陽(yáng)性。 (注)Kofacs試劑:取對(duì)二甲基氨基苯甲醛(Paradimethylamino benzaldehyde)4g,加95%酒精380ml,濃鹽酸80ml即成。 2.IMViC 包括下述四種試驗(yàn):① 靛基質(zhì)產(chǎn)生(Production of indole)將細(xì)菌接種于蛋白胨水中,37℃培養(yǎng)18~24h。必要時(shí)可培養(yǎng)更長(zhǎng)時(shí)間后再判定結(jié)果。用于尿素分解試驗(yàn)。用于檢測(cè)硫化氫的產(chǎn)生。 用于枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)。用于V—P試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)。常用于糖發(fā)酵試驗(yàn)。 2.糖發(fā)酵管
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