【正文】 。 8．將制備管置于潔凈的 ml 離心管 (試劑盒內(nèi)提供 )中，在制備膜中央加 2530 μl Eluent 或去離子水，室溫靜置 1 min。以同樣的方法再用 700 μl Buffer W2洗滌一次 12,000 g離心 1 min。 2 ml離心管，加 500 μl Buffer W1，12,000 g 離心 30 s，棄濾液。 Buffer DEA 體積的 Buffer DEB，混合均勻； 4. 吸取步驟 3中的混合液，轉(zhuǎn)移到 DNA制備管（置于 2 ml（試劑盒內(nèi)提供）離心管）中， 12,000 g 離心 1 min。 3個(gè)凝膠體積的 Buffer DEA，混合均勻后于 75oC加熱（低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠于 40176。 材 料 ： 含有目的基因酶切產(chǎn)物的凝膠塊 試 劑 ： AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒 ；無水乙醇； 三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑 四、實(shí)驗(yàn)步驟 DNA 的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1. 從含有 目的基因片段凝膠塊上回收 DNA。這個(gè)方法現(xiàn)在用的人已經(jīng)不多了。但是這個(gè)方法不適合用于大片斷的回收。全程不過 10多分鐘，得到的產(chǎn)物溶液可以直接用于后繼實(shí)驗(yàn)。 ，再加入 5－ 10μl EB ，將凝膠放入盤中 2－ 3 分鐘 ，再紫外燈下檢測(cè)PCR產(chǎn)物的 DNA條帶 pSKCIPK酶切產(chǎn)生的目的基因帶從凝膠上切下來，切下的凝膠塊要盡量??； 一、實(shí)驗(yàn)原理 通過一定的方法將瓊脂糖凝膠上需要的目的 DNA帶回收下來，用于下游實(shí)驗(yàn)。 2. 將制膠板放好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃ ）倒入，室溫冷卻凝固 3. 充分凝固后將膠板取出，小心垂直向上拔出梳子，置入電泳槽中，加 TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠 12mm。 材 料 ： pMDGene酶切產(chǎn)物 pET32a酶切 試 劑 ： 瓊脂糖， 1 TAE電泳緩沖液 、 溴化乙錠（ EB）、 6 Loading buffer、無菌去離子水、 DNA Marker； 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 1g 瓊脂糖加入 100ml TAE電泳緩沖液中，搖勻。 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1 瓊脂糖凝膠電泳分析 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)； 2 將目的基因片段從凝膠上切下來，為目的基因片段凝膠回收作準(zhǔn)備。帶 d 后綴的載體閱讀框和帶 c 的一樣，不同的是它們有一個(gè)上游Nco I 克隆位點(diǎn)而非 Nde I 位點(diǎn)以便直接將目的基因克隆到 AUG起始密碼子。 ? 翻譯載體在命名上與轉(zhuǎn)錄載體不同，多一個(gè)字母后綴，例如 pET21a(+)，表示相對(duì)于 BamH I 克隆位點(diǎn)識(shí)別序列 GGATCC 的閱讀框。只有 3 種轉(zhuǎn)錄載體： pET 21(+)、 pET 24(+)和 pET23(+)。 載體大致可分為兩大類：轉(zhuǎn)錄載體和翻譯載體。 內(nèi)切酶： BamH I 內(nèi)切酶緩沖液 : 10*Buffer K ddH2O 推薦一般反應(yīng)體系 四、實(shí)驗(yàn)步驟 酶切反應(yīng)體系如下 (20μl )： 10*Buffer K 2μl 質(zhì)粒 DNA 3μl BamH I 1μl 補(bǔ)充 ddH2O到總體積 20μl 注：重組質(zhì)粒濃度為 12μ g/μ l ，短暫離心，于 37OC反應(yīng)23小時(shí) 一、實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)十 電泳分析酶切反應(yīng)及目的基因膠回收 pMDGene酶切分析 Marker pBluescriptCIPK酶切之前對(duì)照 pMD1433酶切之后產(chǎn)生較大的質(zhì)粒帶和較小的目的基因帶 pET32a酶切分析 pET 系統(tǒng)是有史以來在 中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)。 BamH I pET32a多克隆位點(diǎn)上也有 BamHI位點(diǎn) f i o r i g i nA p ro r it r x Al a c IT 7 p r o m o t e rM C SA v a IX h o IE a g IN o t IH in d I I IS a l IE c o R IS a c IB a m H IE c o R VN c o IB g l I IK p n IT 7 t e r m i n a t o rp E T 3 2 a ( + )5 9 0 0 b p克隆基因引物也加入了 BamHI位點(diǎn) ? Primer5’:GGATCCATGGCGGAGAAAATCACG ? Primer3’:GGATCCCTATTCAGTGTCAGACGGCAAG 影響酶切反應(yīng)的因素 1. DNA 純度 2. 緩沖液 3. 溫度條件 4. 甘油含量 ? 溫度 ： 37OC（ BamH I 30OC） ? 甘油 ：控制在 10％以下 Takara公司提供的不同緩沖液 BamH I 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1 掌握限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)原理和方法； 2 將上一實(shí)驗(yàn)獲得的重組質(zhì)粒及表達(dá)載體 pET進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化 （注：不需要酶切 pET質(zhì)粒，老師已經(jīng)為大家切好了） 三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑 儀器及耗材 ：臺(tái)式離心機(jī)、微量移液器及吸頭、 EP管、恒溫水浴鍋。 Ⅱ 類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中 ,有的在對(duì)稱軸處切割 ,產(chǎn)生平末端的 DNA 片段 (如 SmaⅠ :5‘CCC↓GGG3’)。 實(shí)驗(yàn)九 重組質(zhì)粒及表達(dá)載體 pET酶切分析 分子克隆中廣泛應(yīng)用的是： Ⅱ 類中的限制性內(nèi)切酶。 Ⅱ 類由兩種酶組成 : 一種為限制性內(nèi)切核酸酶 (限制酶 ),它切割某一特異的核苷酸序列 。 限制性內(nèi)切酶 可分為三類 : Ⅰ 類和 III酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾 (甲基化 )作用且依賴于 ATP 的存在。 8. 4℃ ,12,000 rpm， 10 min 9. 將水相移入干凈 EP 管中 ,加入 倍體積的異丙醇 ,振蕩混勻后，然后 4℃ ,12,000 rpm， 10 min； 10. 棄上清 ,將管口敞開倒置于吸水紙上使所有液體流出 ,加入 70％乙醇洗沉淀一次 , 4℃ ,12,000 rpm，5 min； 11. 吸除上清液 ,將管倒置于吸水紙上使液體流盡 , 室溫干燥。 加入 300μl 預(yù)冷的溶液 Ⅲ ,溫和轉(zhuǎn)動(dòng) EP管至絮狀沉淀出現(xiàn)，冰浴中 510分鐘 ,4℃ ， 12,000 rpm, 10 min。 取菌液入 EP 管中 ,4℃ ， 8,000 rpm, 5min。 溶液 Ⅲ ： 5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 ， H2O ，定容至 100ml, 并高壓滅菌。 溶液 Ⅰ 配制后高壓滅菌 15 分鐘 ,儲(chǔ)存于 4℃ 冰箱。 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1 了解質(zhì)粒各種提取方法 2 通過堿法提取重組質(zhì)粒 三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑 儀器及耗材 ：三角瓶、超凈工作臺(tái)、臺(tái)式離心機(jī)、微量移液器及吸頭、 EP管、 DNA振蕩器。如果質(zhì)粒 DNA 兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂 ,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力 ,形成松馳型的環(huán)狀分子 ,稱開環(huán) DNA；如果質(zhì)粒 DNA 的兩條鏈在同一處斷裂 ,則形成線狀 DNA。 在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi) ,共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。 ? 采用何種方法取決于三個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株和裂解后用于純化質(zhì)粒 DNA技術(shù)。在質(zhì)粒復(fù)制子調(diào)控下，質(zhì)?？截悢?shù)可隨細(xì)菌培養(yǎng)條件變化而在較窄的范圍波動(dòng)，生長(zhǎng)條件恒定，質(zhì)粒增殖速度與宿主細(xì)胞增殖速度完全一致，拷貝數(shù)保持不變。 實(shí)驗(yàn)八 重組質(zhì)粒的提取 1. 細(xì)菌培養(yǎng) ? 質(zhì)粒的擴(kuò)增與質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)和細(xì)菌個(gè)數(shù)正相關(guān)。 一、實(shí)驗(yàn)原理 從細(xì)菌中分離質(zhì)粒 DNA 方法包括 3 個(gè)基本步驟 : ； 。 IPTG是異丙基硫代半乳糖苷為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo) lacZ的表達(dá)。 四 實(shí)驗(yàn)步驟 3. 將 PCR管放置到 PCR儀中，蓋好蓋子； 4. 用 94oC預(yù)變性 35分鐘； 94oC變性 1分鐘，58oC退火 1 分鐘 , 72oC延伸 2 分鐘 , 32個(gè)循環(huán)；最后一輪循環(huán)結(jié)束后 , 于 72oC下保溫10 分鐘； 5. 終止反應(yīng)，從 PCR儀取出 PCR管，放置4oC存。 Taq DNA 聚合酶 。 dNTP Mix(每種 )。 三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑 儀器及耗材 ：培養(yǎng)皿、電熱恒溫培養(yǎng)箱、無菌工作臺(tái)、牙簽、 PCR管、各種 tip、 PCR儀。 ? 后來該方法進(jìn)一步改進(jìn)，利用牙簽直接沾取一點(diǎn)單菌落作為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)更大量節(jié)省了時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作程序，單菌落 PCR可以有效的篩選陽性重組克隆?？梢酝ㄟ^菌落 PCR進(jìn)一步鑒定含有重組質(zhì)粒的陽性菌落。所以，有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒有重組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色。所以稱這種現(xiàn)象為 ?互補(bǔ)現(xiàn)象。在各自獨(dú)立的情況下 , pMD18T 和 DH5α 編碼的 β 半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn) ,但并沒有破壞 lacZ 的閱讀框架 ,不影響其正常功能。此為初步的抗性篩選。 pMD18T Vector的結(jié)構(gòu) 因 pMD18T帶有 Ampr 基因而外源片段上不帶該基因 ,故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有pMD18T DNA 的轉(zhuǎn)化子才能在含有 Amp 的 LB 平板上存活下來 （質(zhì)粒自身環(huán)化和重組載體） 。 一 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)七 陽性克隆的鑒定和篩選 在我們的實(shí)驗(yàn)中，目的基因與 T載體 (pMD18T)連接產(chǎn)物 ,轉(zhuǎn)化 E. coli DH5α菌株。 四 實(shí)驗(yàn)步驟