【正文】 You are dismissted ！ Bye bye ！ 。 ? 在各類有害生物中，昆蟲、螨類、雜草種子等已有較好的大量除害處理方法，而植物病原物多缺乏簡便、易行、效果較高的處理方法，需進(jìn)一步研究。當(dāng)不合格的檢疫物沒有有效的處理方法，或雖有處理方法，但在經(jīng)濟(jì)上不合算，時(shí)間不允許的，應(yīng)退回或采用焚燒、深埋等方法銷毀。種苗可有條件地調(diào)往有害生物的非適生區(qū)使用。 避害處理 —— 改變用途 ? 例如，植物種子改用于加工或食用。 熱處理殺滅木質(zhì)包裝中松材線蟲的技術(shù)研究 避害處理 —— 限制卸貨地點(diǎn)和時(shí)間 熱帶和亞熱帶植物產(chǎn)品在北方口岸卸貨、加工，北方特有的農(nóng)作物產(chǎn)品調(diào)往南方進(jìn)口加工?；瘜W(xué)處理是種子、苗木等繁殖材料病害防除的重要手段，也常用于交通工具和貯運(yùn)場所的消毒。熏蒸是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的檢疫除害方法。 除害方法 —— 機(jī)械處理 ? 利用篩選、風(fēng)選、水選等選種方法汰除混雜在種子中的菌癭、線蟲癭、蟲粒和雜草種子，人工切除植株、繁殖材料已發(fā)生病蟲危害的部位或挑選出無病蟲侵染的個體。 研究方法 ? 出口盆栽植物栽培土的線蟲分離方法的比較 ? 進(jìn)境木包裝松材線蟲的檢疫方法 ? 線蟲分離器的改進(jìn)和松材線蟲分離特點(diǎn) ? 香蕉穿孔線蟲及其檢測和防疫控制 ? rDNA_ITS_PCR技術(shù)在植物寄生線蟲分子診斷中的應(yīng)用 檢疫處理的原則和方法 檢疫處理的原則： 高效、環(huán)保、快速、經(jīng)濟(jì)、安全 方法： 檢疫處理可采取 除害 、 退回 ， 銷毀 等多種措施。因此，要仔細(xì)觀察，測量較多的數(shù)量，防治把種內(nèi)變異鑒定位不同的種。 檢疫性線蟲的一般檢驗(yàn)程序及注意事項(xiàng) ? 程序 ： ? 根據(jù)習(xí)性進(jìn)行分離 ? 殺死和固定 ? 制作玻片 ? 顯微測量線蟲的主要特征 ? 種內(nèi)鑒定 ―― 查閱文獻(xiàn)，結(jié)合主要特征鑒定。 ? 化學(xué)殺死 ：加入化學(xué)藥劑。 線蟲的殺死固定技術(shù) ? 熱力殺死 ： ―― 在災(zāi)玻片上加熱5－ 6s，線蟲突然伸直時(shí)即殺死了。 ? 卡勃過篩分離法 ―― 本法用于從大量土壤中分離各類線蟲。 植物寄生線蟲的各種分離方法 直接解剖法 內(nèi)生線蟲在體視顯微鏡下用解剖針直接解剖病組織 ? 簡易貝爾曼漏斗法 :分離少量植物材料中有活動能力的線蟲。 罹病樣品的采集及保存方法 罹病植物 ―― 采集有明顯癥狀的地上或地下部分 土壤樣本 ――20 － 30cm耕作層的土壤，定點(diǎn)或棋 盤式多點(diǎn)采樣。其優(yōu)點(diǎn)是可檢測同種病毒的不同株系， 還可檢測類病毒、衛(wèi)星 ＲＮＡ 以及某些不能形成病毒粒體蛋白的病毒分離物； 缺點(diǎn)是同位素標(biāo)記有放射性污染及安全問題。在發(fā)夾關(guān)閉時(shí)，熒光染料和猝滅劑極端靠近，熒光幾乎完全被猝滅 分子信標(biāo) (Molecular beacon) 變性：“分子信標(biāo)”柄部因高溫變性而呈卷曲狀，熒光染料遠(yuǎn)離淬滅劑，發(fā)出熒光 分子信標(biāo) (Molecular beacon) 退火：“分子信標(biāo)”發(fā)夾環(huán)部因與靶序列互補(bǔ)而雜交，“分子信標(biāo)”發(fā)夾完全展開，發(fā)出熒光：如無靶序列存在“分子信標(biāo)”因柄部序列互補(bǔ)回復(fù)發(fā)夾，無熒光 分子信標(biāo) (Molecular beacon) 延伸：“分子信標(biāo)”因升溫與靶序列脫離，延伸反應(yīng)順利進(jìn)行 分子信標(biāo) (Molecular beacon) 反應(yīng)結(jié)束：“分子信標(biāo)”與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比 分子信標(biāo) (Molecular beacon) 雜交誘捕 PCRELISA原理 實(shí)時(shí)熒光 PCR原理 核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù) ? 原理 ：采用帶有放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的已知序列核酸單鏈作為探針， 在一定條件下與靶病毒的核酸單鏈退火形成雜交雙鏈。 免疫用抗原來源 ? 提純病毒粒子； ? 原核或真核表達(dá)外殼蛋白 單克隆抗體的制備 多克隆抗體的制備 抗 原 分子生物學(xué)檢測方法 ? 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) ? 分子信標(biāo) (Molecular beacon) ? TaqMan實(shí)時(shí) RTPCR (Realtime RTPCR) ? 核酸雜交技術(shù) (Nucleic acid hybridization) 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) ? RTPCR ? 嵌套 PCR ? 雙重 PCR ? 多重 PCR ? 雜交誘捕 PCRELISA ? 實(shí)時(shí)熒光 PCR 反應(yīng)前：“分子信標(biāo)”為一發(fā)夾型探針，探針的柄部兩端序列互補(bǔ)，使其呈發(fā)夾狀，環(huán)與靶序列互補(bǔ)。其原理是把待測病毒的抗體吸附在乳膠顆粒上，通過大顆粒乳膠間接反應(yīng)小顆粒病毒的存在，所不同的是RIPA使用了一種紅色乳膠，從而使檢測更加簡單和直觀， RIPA測檢測提純 TMV的靈敏度分別可達(dá) 5ngPml/50ngPml 免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique) G處為金標(biāo)抗體 (免疫金 )， T處包被抗體， C處包被抗金標(biāo)抗體， B處為吸水紙。 電子顯微鏡觀察 ? 目前通常認(rèn)為運(yùn)用負(fù)染和超薄切片電鏡觀察能診斷和鑒別植物病毒，一般可診斷到屬的水平。 非典型肺炎”元兇冠狀病毒 生物學(xué)檢測技術(shù) ? 鑒別寄主檢測 以鑒別寄主反應(yīng)或指示植物為依據(jù)的方法。 分子檢測試劑盒 研究方法 ? 河北鴨梨黑斑病病原菌的鑒定 ? 番茄上兩種細(xì)菌性病害的診斷與防治 ? 梨火疫病菌噬菌體的初步研究 ? Biolog系統(tǒng)和 16SrDNA序列分析方法在植物病原細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用 第三節(jié) 植物病毒檢驗(yàn)檢疫技術(shù) ? 病毒 （ virus） 是一組 （ 一種或一種以上 ） DNA或RNA核酸分子 ， 包圍在蛋白或脂蛋白外殼內(nèi) ， 在合適的寄主細(xì)胞借助于寄主蛋白合成體系 、 物質(zhì)和能量完成復(fù)制 ， 伴隨核酸突變發(fā)生變異 。擴(kuò)增 DNA保守區(qū)域的引物通常稱做通用引物，己經(jīng)在廣泛的系統(tǒng)進(jìn)化變異細(xì)菌中應(yīng)用，來擴(kuò)增核糖體基因片段。 特異性基因或 DNA序列用于檢測病原菌 ? 利用病原菌的致病基因 以病原菌的致病基因?yàn)槟繕?biāo)，設(shè)計(jì)特異性引物，通過 PCR擴(kuò)增進(jìn)行病原菌特異性檢測 ? 例如土壤桿菌 Agrobacterium的菌株，所有致病菌株都有介導(dǎo) DNA在細(xì)菌和寄主間轉(zhuǎn)導(dǎo)的毒性基因(Vir基因 )，詳細(xì)了解致病機(jī)制后，可以設(shè)計(jì)出許多針對該致病性基因序列的 DNA引物。 ? 靈敏度取決于每次分析樣品中目標(biāo)病原菌的最低劑量，以及樣品制備方法對 PCR反應(yīng)的影響。 免疫熒光技術(shù) 診斷試劑盒 分子檢測技術(shù) PCR檢測技術(shù)是利用相應(yīng)的引物，在DNA聚合酶催化下對目標(biāo) DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無來判斷檢測的結(jié)果。 雙抗體夾心法 間接法 ? 競爭法 免疫熒光技術(shù) ? 原理 將熒光物與微生物抗體結(jié)合得到熒光抗體，熒光抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下發(fā)生熒光，以此來檢測抗原。 ? ELISA的特征 :靈敏度高，特異性強(qiáng)，安全、快速并易觀察。 取 10g稻種，脫下谷殼，剪碎或磨碎， 放入已滅菌處理的燒杯中 取 10g稻種，脫下谷殼，剪碎或磨碎， 放入已滅菌處理的燒杯中 混勻后加入 10ml融化的肉汁胨瓊脂 培養(yǎng)基，搖勻凝成平板 在 2528℃ 溫箱中，培養(yǎng) 1012h 記載各培養(yǎng)皿中的噬菌斑數(shù)