【正文】 和萌發(fā)率 ? 分離塊莖、塊根和苗木、接穗等繁殖材料所帶的病菌 分離培養(yǎng)檢驗(yàn)步驟 消毒 接種 培養(yǎng) 研究方法 ? 進(jìn)境美國小麥中黑麥草腥黑穗病菌的檢測和鑒定（洗滌檢測和熒光 PCR） ? 水稻腥黑粉病菌的單孢檢測（分離培養(yǎng)） ? 大豆疫病的田間鑒定與防治 第二節(jié) 病原細(xì)菌的檢疫檢驗(yàn)技術(shù) ? 植物細(xì)菌病害有軟腐、環(huán)腐、萎蔫、潰瘍、瘡痂、枝枯、葉斑、組織增生（癭瘤、發(fā)根）等多種癥狀。病部切片鏡檢可見細(xì)菌溢。 ? 初步診斷 ―― 通過肉眼觀察植株的癥狀、病原分泌物以及鏡檢觀察。 進(jìn)一步診斷 ? 分離培養(yǎng)：選擇新鮮的病斑或病鍵組織交界處 ―― 表面消毒 ―― 清水洗凈 ―― 碾碎稀釋―― 劃線培養(yǎng) ―― 觀察 提取液系列稀釋 在金氏 B（ KB）培養(yǎng)基平板上涂布 在 25℃ 和無光照條件下培養(yǎng) 3d后 紫外光或近紫外光照射下有藍(lán)色熒光的 菌落，為假單胞桿菌，可能是暈?zāi)璨【? 選擇典型菌落作進(jìn)一步的鑒定 菜豆種傳暈?zāi)璨【姆蛛x ? 致病性測定：目的是區(qū)分致病性細(xì)菌和腐生菌。 大部分病原細(xì)菌，特別是 Pseudomonas屬的病原細(xì)菌注射到煙草葉片上，能在 24小時內(nèi)產(chǎn)生枯斑反應(yīng)。常用的接種方法有噴霧、注射、針刺和浸泡等。 ? Biolog 測定：美國 Biolog 公司研制的專門鑒定細(xì)菌的專家系統(tǒng)。 噬菌體檢測 ? 噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，能在活細(xì)菌細(xì)胞中寄生繁殖，破壞和裂解寄主細(xì)胞，在液體培養(yǎng)時，使混濁的細(xì)菌懸浮液變得澄清，在固體平板上培養(yǎng)時，則出現(xiàn)許多邊緣整齊，透明光亮的圓形無菌空斑，稱為“噬菌斑”，肉眼即可分辯 。 ? 缺點(diǎn)是非目標(biāo)菌多量存在時敏感性較差，噬菌體的寄生專化性和細(xì)菌對噬菌體的抵抗性都可能影響檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 血清學(xué)檢測技術(shù) 血清學(xué)檢測技術(shù) ? ELISA的測定方法 :直接法、間接法、競爭法、酶抗酶法、雙夾心法、雙抗體夾心法等 6種。它可進(jìn)行定性定量測定，適于大批量樣品的檢查、可用于病害普查，口岸檢疫和產(chǎn)地檢疫等。 ? 免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法兩種，在實(shí)踐中常用間接法，一抗與結(jié)合有熒光色素的二抗結(jié)合，通過免疫熒光顯微鏡來檢測所發(fā)出的熒光。 分子檢測技術(shù) ? 其特異性取決于引物和擴(kuò)增反應(yīng)條件 。 ? PCR的快速檢測，引物尤其重要，通常有下列特異性基因和 DNA序列供設(shè)計 PCR引物用于檢測和鑒定病原菌。 核糖體 DNA基礎(chǔ)的 PCR策略 ? 細(xì)菌核糖體 DNA的操縱子由 3個有功能的保守序列 16SrDNA, 23SrDNA和 5SrDNA組成，由可變異的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (Internally Transcribed Spacer, ITS)分隔。通過核糖體基因庫 (ht tp : //. cme. msu. edu/RDP/)和核糖體基因擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析，選擇病菌?；蛄?，設(shè)計?；铮梢杂脕韺；瘷z測病原細(xì)菌。 ? 主要特征 ： ① 結(jié)構(gòu)簡單的 （ 核酸 +蛋白或脂蛋白衣殼 ） ； ② 嚴(yán)格專性寄生的 （ 依賴寄主的核酸和蛋白質(zhì)合成系統(tǒng) ） ； ③ 非細(xì)胞生物 （ 分子寄生物 ） 。 ? 曾廣泛運(yùn)用，目前卻由于其檢測速度慢、受環(huán)境和季節(jié)影響較大等諸多因素限制，而運(yùn)用較少。 免疫學(xué)檢測法 ? 酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) ? 快速免疫濾紙測定法 (Rapidimmuno afterpaperassay,RIPA) ? 免疫膠體金技術(shù) (Immune colloidal gold technique) ? 免疫印跡法 Western印跡 (Western blot)；斑點(diǎn)免疫結(jié)合技術(shù) (Dot immunobinding assay, DIBA ) ? 組織免疫印跡 (Tissueblot immunoassay, TBIA ) 快速免疫濾紙測定法 (Rapidimmuno afterpaperassay,RIPA) ? 快速免疫濾紙測定類似乳膠凝集反應(yīng)。測試時 A端滴加待測標(biāo)本，通過層析作用，待測標(biāo)本向 B端移動，流經(jīng) G處時將金標(biāo)抗體復(fù)溶，若待測標(biāo)本中含待測抗原，即形成金標(biāo)抗體 抗原復(fù)合物，移至 T區(qū)時，形成金標(biāo)抗體 抗原 抗體復(fù)合物，金標(biāo)抗體被固定下來，在 T區(qū)顯示紅色線條，呈陽性反應(yīng)，多余的金標(biāo)記抗體移至 C區(qū)被抗金標(biāo)抗體捕獲，呈現(xiàn)紅色質(zhì)控線條。位于柄部的５’和３’端分別標(biāo)記熒光染料和猝火劑。通過雜交信號的檢測， 檢測出樣本中病毒的基因組份。 分子生物學(xué)和免疫學(xué)相結(jié)合檢測方法 ? 免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄 PCR（ Immunocapture reverse transcript PCR, ICRTPCR） 反轉(zhuǎn)錄 PCR擴(kuò)增 研究方法 ? 日本進(jìn)口南瓜的病毒隔離檢疫和田間疫情監(jiān)測 ? 煙草環(huán)斑病毒的檢疫檢測方法 ? 番茄斑萎病毒的檢疫技術(shù) ? 侵染觀賞南瓜的黃瓜綠斑駁花葉病毒的初步鑒定 第四節(jié) 植物病原線蟲的檢疫檢驗(yàn)技術(shù) ? 植物病原線蟲是軀體很小，而內(nèi)部又有各種較復(fù)雜器官的低等動物，再加上其一些特殊的分布和生物學(xué)習(xí)性等，檢測方法有所不同。 保存方法 ―― 所有材料均應(yīng)裝入塑料袋中保濕，及時分離或 4度低溫保存。 浸入漏斗 12h 清洗材料 切成小段 收集線蟲 裹紗布 ? 淺盤法 ――20 目和 300目的網(wǎng)篩各一個，材料放入鋪有線蟲濾紙的不銹鋼盆內(nèi)， 25度左右浸泡 1d，過篩收集線蟲。 ? 懸浮土壤 ―― 靜置 ―― 過篩，由大到小。 殺死 ――65 度水浴中加熱 2min。 ? 固定技術(shù) ―― 特定固定液中，制作臨時玻片和永久玻片。 A 幼蟲 側(cè)區(qū) E. 雄蟲體前部 注意事項(xiàng) ? 正確判別玻片種線蟲的體位 ―― 前提 ? 群體的概念 ―― 同一種線蟲，因寄主、營養(yǎng)及環(huán)境條件的變化，種內(nèi)蟲體間有一定的變異范圍。 ? 了解各類線蟲的生活史，正確區(qū)分幼蟲和成蟲 ―― 成蟲 的形態(tài)特征是鑒定的重要依據(jù)。除害是檢疫處理的主要措施，它通過直接鏟除有害生物而保障貿(mào)易和引種安全。 除害方法 —— 熏蒸處理 ? 利用熏蒸劑，在密閉設(shè)施內(nèi)處理植物或植物產(chǎn)品，以殺死害蟲和螨類，部分熏蒸劑兼有殺菌作用。 ? 溴甲烷（ CH3Br） ? 磷化鋁 ? 氫氰酸（ HCN） ? 二溴乙烷（ CH4Br2） ? 氯化苦（ CCl3N02） ? 環(huán)氧乙烷（（ CH2） 2O） ? 硫酸氟（ S02F2） ? 集裝箱溴甲烷熏蒸散氣速率的初步研究 除害方法 —— 化學(xué)處理 ? 利用除熏蒸劑以外的化學(xué)藥劑殺死或抑制有害生物，并保護(hù)檢疫物在貯運(yùn)過程中免受有害生物的污染。 除害方法 —— 物理處理 常用高溫、低溫、微波、高頻、超聲波以及核輻照等處理方法，多兼具殺菌、殺蟲效果，對處理種子、苗木、水果、食品等有較好的應(yīng)用前景。植物產(chǎn)品若帶有不耐嚴(yán)寒低溫的有害生物，則可在冬季進(jìn)口、加工。 避害處理 —— 限制使用范圍和加工方式 進(jìn)口糧谷可集中在少數(shù)城市采取合理工藝加工，以防止有害廢棄物進(jìn)入田間。 退回和 銷毀 ? 也是重要的處理措施。國際航機(jī)、輪船、車輛的垃圾、動植物性廢棄物、鋪墊物等均應(yīng)用焚化爐銷毀。但是，即使是成功的處理方法，隨著有害生物、植物和環(huán)境條件諸因素的變化，也需不斷改進(jìn)