【正文】 利用 “Group”命令進行標(biāo)記間的連鎖分析和分組（ LOD＝ ），連鎖標(biāo)記數(shù)小于 8 個的使用 Compare 命令進行排序，標(biāo)材料與方法 19 記數(shù)大于等于 8 個的要重復(fù)使用 Ripple。由一對引物擴增出多個差異帶的，分別記為引物名加 0 02，依此類推。 數(shù)據(jù)整理與分析 數(shù)據(jù)記錄 統(tǒng)計 在親本之間產(chǎn)生 的 多態(tài)性并且在群體中有分離的條帶 ， AFLP 標(biāo)記中的共顯性標(biāo)記按顯性標(biāo)記記錄， 與 親 本 A1543 帶型相同者賦值為 A，與 親 本 P9903 帶型相同者賦值為 B，由于 各種原因造成的數(shù)據(jù)不清楚或數(shù)據(jù)缺失者賦值為 “ － ”。 5） 終止 將玻璃板取出放入醋酸溶液中，終止 2min 左右。 3） 染色 將上板放入染色液（ 2L 蒸餾水中加入 2g 硝酸銀和 3ml 甲醛）中，染色 30min。 （ 3） 銀染 1） 固定 將玻璃板從電泳槽取下，拔出梳子，將長板和短板分離，將長板取下，放入 2L10%醋酸溶液中浸泡，輕輕搖動 20~30min。 （ 2） 電泳 將玻璃板裝到電泳槽中，上槽緩沖液為 TBE，下槽為 1 TBE 緩沖液 進行電泳。灌完后，將梳子插 入適當(dāng)位置，將板調(diào)至水平。 2） 涂板 將配好的 Repel 溶液均勻地涂在短板上， Binding 溶液均勻涂在長板上，室溫放置 20min以上。 然后 在 6％ 聚丙烯酰胺凝膠上 進行 電泳， 75w 恒功率電泳 2h 左右， 待 二甲苯青跑到垂直板的下沿為宜，然后采用銀染法顯色。 選擇性擴增 反應(yīng)體系如下 ： 稀釋后預(yù)擴增產(chǎn)物 ?l MseIprimer（ 50ng/μl ） ?l EcoRIprimer（ 50ng/?l） ?l dNTPs（ ） ?l 10 X buffer ?l Mg2＋ （ 25mM） ?l 材料與方法 17 PCR 程序 ： 94 ?C 5 min 94 ?C 30 sec 65 56 ?C （每循環(huán)下降 ?C） 30 sec Total 12cycles 72 ?C 60 sec 94?C 30 sec 56?C 30 sec Total 24 cycles 72?C 60 sec 72?C 5 min 同樣取 5?l 選擇性擴增 產(chǎn)物在 1％瓊脂糖凝膠中檢測，彌散 條帶中可以看出深淺不一的條帶。 預(yù)擴增 預(yù)擴增 體系如下： 酶切連接后模板 ?l EcoRIprimer（ 50 ng/?l） ?l MseIprimer（ 50 ng/?l） ?l dNTPs（ ） ?l 10 x PCR buffer ?l Mg2＋ （ 25mM） Taqpolymerase（ 5units/?l） ?l MilliQ H2O ?l 總體積 ?l PCR 程序： 94℃ 5 min 94℃ 30 sec 56℃ 30 sec 24cycles 72℃ 1 min 72℃ 5 min 取 5?l 產(chǎn)物在 1％ 瓊脂糖凝膠中檢測，較理想的 預(yù) 擴增產(chǎn)物在 50~600bp 之間產(chǎn)生均勻的彌散 。 （ 16） 取 2ulDNA，以 λDNA為對照進行瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的濃度，稀釋為 100 ng/ul 左右 ， 20℃ 保存?zhèn)溆谩? （ 15） 加入 TE 溶解 DNA。無水乙醇漂洗 1 次。輕輕混勻后在 20℃ 靜置 30min，至白色 DNA 析出。 5℃ 以上， 10000rpm 離心 10min。在 5℃ ，10000rpm 離心 10min。 （ 11） 加入等體積的氯仿：異戊醇（ 24： 1）輕輕轉(zhuǎn)動搖勻。 （ 10） 加滅菌的超純水至 600ul， RNase（ 10mg/ml） 2~3ul，瞬時離心均勻。置于超凈工作臺上吹干 1~2h。輕輕混勻后在 20℃ 靜置 30min，至白色的 DNA 凝結(jié)成絮狀沉淀析出。 （ 6） 用大孔徑的槍頭緩慢吸取上清液，重復(fù) 5步驟，使溶液中蛋白和多糖沉淀充分。 （ 4） 冷卻至室溫后，加入等體積的氯仿：異戊醇（ 24： 1）輕輕轉(zhuǎn)動搖勻。 充分混勻。 （ 2） 2%CTAB 提取液在 水浴鍋中預(yù)熱至 65℃ 。 具體步驟如下： （ 1） 取新鮮的嫩葉 1~2g，去掉葉脈。本試驗按照表 22 的評價標(biāo)準(zhǔn)確定 F2單株的抗病程度。 表 21 病情分級標(biāo)準(zhǔn) Table 21 Classification standards of Chinese Pseudocercosporalla leaf spot disease 病情級別 Level of disease 癥狀 symptom 0 無癥狀 1 葉片上有較少病斑，病斑占葉面積 10﹪以下； 3 病斑占葉面積的 10﹪以上， 20﹪以下； 5 病斑占葉面積的 20﹪以上， 30﹪以下； 7 病斑占葉面積的 30﹪以上， 40﹪以下； 9 病斑 占葉面積的 40﹪以上至全葉枯死。病 情 的分級標(biāo)準(zhǔn)是按病害癥狀的輕重從09 共分 10 個病級，但通常記載時歸并為 0﹑ 1﹑ 3﹑ 5﹑ 7﹑ 9 級。 在培養(yǎng)基上接白斑病菌，待孢子產(chǎn)生后加入滅菌水，用玻璃將分生孢子洗下，配成孢子懸浮液，用噴霧器噴灑在白菜葉片上，在 25℃條件下保 濕 24 小時后，每天觀察一次，觀察是否發(fā)病及病斑發(fā)展情況。待幼苗出土后間苗，每盆留大小一致的幼苗一株，常規(guī)管理備用。 藥品： Taq 酶（ TaKaRa）、 dNTP（ TaKaRa）、 λDNA marker、 DL2021Marker、 三羥甲基氨基甲烷（ Tris）（ Amresco）、 CTAB、 乙二胺四乙酸二鈉鹽（ EDTA）（ Amresco）、氯仿（國產(chǎn)）、異戊醇（國產(chǎn)）、溴化乙錠（ EB）（ Sigma）、溴酚藍（國產(chǎn)）、丙烯酰胺（ Acrylamide）（ Amresco）、甲叉雙丙烯酰胺（ Bis）（ Amresco）、過硫酸銨（ Sigma）、 TEMED（ Amresco）、剝離硅膠（進口）、粘合硅膠（進口）、瓊脂糖（ Agarose）（西班牙）、無水乙醇（國產(chǎn)）、 β 巰基乙醇（進口）、 PVP（德國）、尿素（ Amresco）等。 毒原 2021 年在黑龍江省哈爾濱市香坊農(nóng)場采集分離獲得的白斑病菌 P0811。抗病材料 A1543 和感病材料 P9903 雜交后代構(gòu)建 F2 分離群體 248 株，用于大白菜分子遺傳圖譜的構(gòu)建。 主要研究內(nèi)容 （ 1）以 高抗大白菜白斑病的大白菜高代自交系 A1543 和高感大白菜白斑病的大白菜高代自交系 P9903為父母本 ，構(gòu)建了 F2 代群體。這有力地證明了 QTL 的真實存在性，同時也說明，至少對效應(yīng)大 QTL 來說，定位的結(jié)果一般是可靠的。 值得一提的 是，這 3 個 QTL 正好包含在從 RI 群體中發(fā)現(xiàn)的那 5 個 QTL 中。對 RI 群體進行了連續(xù)兩年的抗水稻細(xì)菌性條斑病鑒定，應(yīng)用復(fù)合區(qū)間定位方法 對 所得數(shù)據(jù)進行分析， 定位 了 5 個在兩年試驗中都表現(xiàn)出較大效應(yīng)的 QTL。 尤其 是一些效應(yīng)較大的 QTL 確 實 能在不同的實驗群體中被檢測出來 和 定位也比較相近 等事實足 以 說明 QTL 定位具有一定的可靠性。 QTL 定位的可靠性 人們在開展 各種作物 農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟性狀 QTL 定位 的同時 ，越來越關(guān)注 QTL 定位的可靠性。利用這些效應(yīng)估計值，可預(yù)測基于 QTL主效應(yīng)的普通雜種優(yōu)勢和基于 QTL 與環(huán)境互作效應(yīng)的互作雜種優(yōu)勢，并可直接估算個體的育種值。和基于多元回歸分析的復(fù)合區(qū)間作圖方法相比，混合線性模型方法進行 QTL定位能無偏地分析 QTL與環(huán)境的互作效應(yīng)，具有很大的靈活性，模型擴展方便。其 包括加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)及其與環(huán)境互作效應(yīng)的混合線性模型復(fù)合區(qū)間作圖方法和分析上位性的各項遺傳主效應(yīng)及其與環(huán)境互作效應(yīng)的 QTL作圖方法。該這種方法減少了剩余方差，提高了定位 QTL的靈敏度和精確性，是目前定位多個 QTL的有效、精確的方法。 3 復(fù)合區(qū)間作圖法 為了克服區(qū)間作圖法的不足以及能充分利用多個遺傳標(biāo)記的信息， Zeng (1994)發(fā)展了復(fù)合區(qū)間作圖法 ,利用多元回歸分析實現(xiàn)了同時利用 多個遺傳標(biāo)記信息對基因組的多個區(qū)間進行多個 QTL 的同步檢驗。其已廣泛應(yīng)用于植物的遺傳研究中。其主要缺點表現(xiàn)在檢測到的 QTL通常不會正好在標(biāo)記的座位上，從而造成對該 QTL的位置和效應(yīng)的估計偏差。 QTL 定位的統(tǒng)計分析方法 QTL 作圖的統(tǒng)計模型和方法是利用分子標(biāo)記正確進行 QTL 定位及其效應(yīng)的估計的基礎(chǔ)，自 20 世紀(jì) 80年代以來人們先后創(chuàng)造了 20 多種 QTL 作圖的統(tǒng)計方法，其中應(yīng)用比較廣泛的主要有以下幾種 （ 周元昌等 ， 2021） ： 1 方差分析法 方差分析法是利用單因子方差分析測驗法來分析分離群體中標(biāo)記基因型之間數(shù)量性狀平均值的差異顯著性。其一般步驟包括 :(1)構(gòu)建遺傳連鎖圖；(2)獲得適宜的作圖群體； (3)檢測分離世代群體中每一個體的標(biāo)記基因型和數(shù)量性狀值； (4)分析標(biāo)記基因型和數(shù)量性狀值的相互關(guān)聯(lián)，確定 QTL 在染色體上的相對位置 ,估計 QTL 的有關(guān)遺傳參數(shù)（ 周明全， 2021） 。通過 與 QTL 連鎖的分子標(biāo)記 對 在育種中對有關(guān)的 QTL 的遺傳動態(tài)進行跟蹤，大大 地 增強人們對數(shù)量性狀的遺傳操縱能力，提高育種中對數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的準(zhǔn)確性和預(yù)見性。 隨著 分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為深入研究數(shù)量性狀的遺傳基礎(chǔ)提供了可能。以往對于數(shù)量性狀的研究我們 只能借助于數(shù)理統(tǒng)計的手段，將控制數(shù)量性狀的多基因系統(tǒng)作為一個整體來研究，數(shù)量性狀的遺傳特征 采用 平均值和方 差來反映， 不能 了解單個基因的位置和效應(yīng)。與質(zhì)量性狀 相比 ，對數(shù)量性狀的遺傳研究 就 十分困難。 Kim（ 2021）利用 AFLP 和 RAPD 分子標(biāo)記，通過 DH 群體建立了大白菜遺傳圖譜，該 圖譜包括 272 個標(biāo)記， 11 個連鎖群，總長 cM， 標(biāo)記間平均間隔為 cM。 韓國在大白菜遺傳圖譜構(gòu)建上居領(lǐng)先地位， Kim（ 1998）用 F2 群體構(gòu)建了含有 115 個 RFLP 標(biāo)記，總長 1382cM， 標(biāo)記間平均遺傳距離為 ， 包含 10 個連鎖群的遺傳圖譜。 盧剛 （ 2021）利用白菜和蕪菁雜交的 F2群體 構(gòu)建了 RAPD 分子遺傳 圖譜。 中國 在蕓薹 屬作圖方面研究較少 ， 張魯剛等 （ 2021） 利用蕪菁 （ Brassica campestris Metzg.） 和結(jié)球白菜 （ B. campestris （ Lour） Olsson.） F2群體，構(gòu)建了 中國 第一個白菜 RAPD 標(biāo)記分子連鎖圖。以后才相繼出現(xiàn)了 RAPD、 STS、 SCARS 和 AFLP 標(biāo)記圖譜 （ Olagercrantz， 1995；Hidetoshi， 1999； Lionon， 2021；于栓倉， 2021） 。 表 11 不同分子標(biāo)記技術(shù)比較 Table 11 Comparison among different molecular marker techniques 種類 RFLP RAPD AFLP SSR SNP 分布 普遍 普遍 普遍 普遍 普遍 可靠性 高 中等 高 高 高 重復(fù)性 高 中 高 高 高 多態(tài)性 低 中 非常高 高 高 遺傳性 共顯現(xiàn) 多為顯現(xiàn) 多為顯現(xiàn) 共顯現(xiàn) 共顯現(xiàn) 放射性 一般有 無 一般有 無 /有 無 技術(shù)難度 中等 簡單 中等 簡單 /中等 中等 DNA 用量 中等 少 多 少 中等 樣品信息量 低 — 中 高 非常高 高 高 時間因素 長 短 中等 短 短 費用 昂貴 低 昂貴 低廉 昂貴 檢測部分 低拷貝編碼區(qū) 整個基因組 整個基因 組 整個基因組 整個基因組 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文 10 蕓薹屬作物遺傳連鎖圖譜的研究進展 蕓薹屬植物遺傳連鎖圖譜的發(fā)展已經(jīng)有 10 多年的歷史 （盧剛， 1999）。隨著 DNA 芯片技術(shù)和重要農(nóng)作物全基因組測序的完成， SNP 標(biāo)記將成為植物遺傳育種研究中的理想遺傳標(biāo)記。 Sachidanandam（ 2021）利用DNA 芯片技術(shù)對人類基因組的 DNA 進行檢測，鑒別出 3241 個侯選 SNP，并將其中的 2227 個 SNP 定位到了遺傳圖譜中，在人類基因組研究中 已 建立了高密度的 SNP 連鎖圖 。隨著檢測技術(shù)和手段的不斷改進，檢測成本大大降低，目前一些生物技術(shù)公司開發(fā)出高通量檢測SNP 技術(shù)，如基因測序、基因芯片等技術(shù)，極大地提高了 SNP 的檢測效率 。 SNP 廣泛存在于基因組中，大約每 1000bp 就有一個 SNP，它不僅存在于非編碼區(qū)，而且存在于編碼區(qū)，其密度比微衛(wèi)星標(biāo)記更高，可以在任何一個待研究基因的內(nèi)部或附近提供一系列標(biāo)記；③易于實現(xiàn)分析的自動化。 和其他分子標(biāo)記相比， SNP 標(biāo)記具有以下優(yōu)越性：①具有較高的遺傳穩(wěn)定性和代表性。 e 與 SSR 相比， AFLP 不需要預(yù)先知道模板 DNA 的序列，而 SSR 設(shè)計引物時需要構(gòu)建cDNA 文