核酸提取及常見問題分析ok(參考版)
2025-05-13 21:40本頁面
【正文】 下游實驗效果不佳 ? RNA 降解 ? 抽提試劑的殘留 75% 乙醇洗滌 ? 樣品中雜質(zhì)的殘留 多糖等雜質(zhì)，再次沉淀 ? DNA 污染 使用 RNaseFree 的 DNase I 消化抽提 RNA RT常見問題分析和解決方案 問題一： 少量或沒有 RTPCR產(chǎn)物 RNA降解 分離無污染，高質(zhì)量的 RNA；防止 RNA降解 RNA中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 70％（ v/v）乙醇清洗 RNA沉淀，除去抑制劑 起始 RNA量太低 增加 RNA的量 多糖同 RNA共沉淀 用氯化鋰沉淀 RNA以除去多糖 合成 cDNA第一鏈合成的引物退火失敗 確定退火溫度適合所用的引物 RNA模板存在較多二級結構 將 RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性 /退火，提高逆轉(zhuǎn)錄反應溫度 反轉(zhuǎn)錄成功， PCR失敗 PCR步驟中使用超過 1/5的逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物 可能原因 解決方案 RT常見問題分析和解決方案 問題二： 有非特異性帶 ? 引物和模板的非特異性退火 ? 基因特異性引物設計較差 ? RNA中有基因組 DNA的污染 ? 形成引物二聚體 ? 鎂離子濃度太高 提高反應的溫度和特異性 提高引物的特異性 使用擴增級 DNaseⅠ 處理 RNA 設計在 339。 電泳帶型異常 ? 非變性電泳： ? 上樣量超過 3ug，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導致 28S 和 18S 條帶分不開。 ? 用水稀釋樣品： ? 測 OD 時 ， 對照及樣品稀釋液請使用 10 mM Tris， pH 。 ? 設備限制： ? 測定 OD260 及 OD280 數(shù)值時 ， 要使 OD260 讀數(shù)在 之間 。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 抽提試劑殘留： ? 確保洗滌時要徹底懸浮 RNA， 并且徹底去掉 75% 乙醇 。 ? 苯酚殘留： ? 不要吸入中間層及有機相 ， 加入氯仿后首先混勻 ， 并且離心分層的離心力和時間要足夠 。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 蛋白質(zhì)污染： ? 不要吸入中間層及有機相 ， 加入氯仿后首先混勻 ， 并且離心分層的離心力和時間要足夠 。 RNA降解 ? 冷凍樣品： ? 樣品取材后應立即置于液氮中速凍 ， 然后可以移至70℃ 冰箱保存 。 影響 RNA提取的因素 第一部分： DNA提取方法簡介 第二部分： DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 內(nèi)容 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對策 常見問題、原因分析及其對策RNA提取常見問題 ? RNA 的降解 ? OD260 /OD280 比值偏低 ? 電泳帶型異常 ? 下游實驗效果不佳 RNA降解 ? 新鮮細胞或組織： ? 裂解液的質(zhì)量 ? 外源 RNase的污染 ? 裂解液的用量不足 ? 組織裂解不充分 ? 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 (如脾臟 ， 胸腺等 )， 很難避免 RNA 的降解 ?？梢韵葘⒉牧腺A存在 TRIzol或樣品貯存液中，于－ 70℃ 或－ 20℃ 保存 ? 如要多次提取，請分成多份保存 ? 液氮長期保存，－ 70℃ 短期保存 影響 RNA提取的因素 ? 樣品破碎及裂解 ： ? 根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法： ? 培養(yǎng)細胞： 通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀? ? 酵母和細菌： 一般 TRIzol可直接裂解，對于一些特殊的材料可先用酶或者機械方法破壁 ? 動植物組織： 先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀 RNA。 ? 沉淀： 異丙醇、無水乙醇。苯酚 /氯仿可
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