【正文】 三、進(jìn)度安排 、論文題目，撰寫(xiě)開(kāi)題報(bào)告； ，撰寫(xiě)文獻(xiàn)綜述 ； 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)儀器、確定實(shí)驗(yàn)過(guò)程、預(yù)實(shí)驗(yàn)； RNA 的提取； PSY 基因的分離并對(duì) 結(jié)果進(jìn)行分析； ，準(zhǔn)備答辯 。 本實(shí)驗(yàn)擬 分離紅肉蜜柚及其親本 琯溪蜜柚果實(shí) PSY 基因全長(zhǎng)，比較分析二者序列是否存在差異，以了解 PSY 基因在突變體中的具體功能，為解釋 紅肉蜜柚發(fā)生變異的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ) 。在番茄和油菜等植物中， PSY 被證實(shí)是類(lèi)胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。了解植物類(lèi)胡蘿卜素積累的特點(diǎn)與代謝的生理機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步調(diào)控植物類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑具有重要的意義。要老師為這樣的小事費(fèi)心，實(shí)在是過(guò)意不去！我還要感謝我的學(xué)弟沈瑤杰、楊黎明，學(xué)妹張和茹對(duì)我實(shí)驗(yàn)的熱情無(wú)私的幫助。在論文的寫(xiě)作過(guò)程中 ， 本人因?yàn)閷?xiě)作基礎(chǔ)差 ， 之前對(duì)論文的寫(xiě)作要求也是沒(méi)有銘記在心 ， 參考文獻(xiàn)和正文的內(nèi)容格式出現(xiàn)很多錯(cuò)誤，所以還要導(dǎo)師大加斧正。但這些位點(diǎn)的突變是否引起 PSY 基因表達(dá)水平的改變，進(jìn)而影響紅肉蜜柚果肉 高 水平積累番茄紅素和 ?胡蘿卜素，仍有待于進(jìn)一步的研究分析。 本研究以紅肉蜜柚和琯溪蜜柚成熟果實(shí) cDNA 為模板，利用 PCR 技術(shù)克隆了八氫番茄紅素合成酶（ PSY）基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到 pUCmT 載體中。細(xì)胞內(nèi)大部份 RNA 均與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。但是，采用改良 Bugos 法提取所得 RNA 仍 存在一定DNA 的污染，因而進(jìn)行其它操作之前進(jìn)行再次 LiCl 沉淀以進(jìn)一步去除 DNA。其中 LiCl 的作用 是在一定 pH 下是 RNA 特異性的沉淀下來(lái)，進(jìn)一步把核酸中的 DNA 和 RNA 進(jìn)行分離，去除 DNA 污染 [23]。所以要從柑橘類(lèi)成熟果實(shí)果肉中提取高質(zhì)量的 RNA 的關(guān)鍵之正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 16 處在于既去除多糖等雜質(zhì)又盡可能地回收 RNA。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料是成熟紅肉蜜柚和琯溪蜜柚的果肉，兩者果肉組織都有大量的多糖類(lèi)物質(zhì)存在，使 RNA成凝膠狀，且難于溶解。由于 RNA 的種類(lèi)來(lái)源和存在形式不同，所用的制備方法各異，一般常用的方法有，熱酚法 [24]， Trizol 法 [25]和異硫氰酸胍法 [26~27]等。內(nèi)源的 RNase 一般利用蛋白質(zhì)變性劑除去，如苯酚、氯仿、胍、 SDS、十二烷基肌氨酸鈉等。除 DEPC外，也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復(fù)合物、 RNA 酶抑制蛋白等。 Tris 溶液可用 DEPC 處理 的水配制然后高壓滅菌。試驗(yàn)所用試劑也可用 DEPC 處理，加入 DEPC 至 %濃度，然后37 ℃ 過(guò)夜處理 ，再煮沸 15 min 或高壓滅菌以消除殘存的 DEPC，否則 DEPC 也能和腺嘌呤作用而破壞 mRNA 活性。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用 %的焦碳酸二乙酯 (DEPC)水溶液處理，再用蒸餾水沖凈。所有的組織中均存在 RNA 酶，人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。因此，對(duì)這一現(xiàn)象內(nèi)在機(jī)理的揭示，將為品種改良及分子育種提供理論基礎(chǔ)，具有非常誘人的應(yīng)用前景。類(lèi)胡蘿卜素代謝中間產(chǎn)物番茄紅素和 ?胡蘿卜素具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但在常見(jiàn)的果實(shí)中，番茄紅素和 ?胡蘿卜素含量很低；有的含量雖高，但又常常積累在非食用部位。本研究選用的材料是琯溪蜜柚及其突變體紅肉蜜柚，兩者親緣關(guān)系相近，不存在種間 、近緣屬間差異。八氫番茄紅素合成酶基因是重要的色素酶基因，存在于所有進(jìn)行光正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 15 合作用的高等植物中。在番茄、油菜、擬南芥和馬鈴薯中過(guò)量表達(dá)八氫番茄紅素合成酶，相應(yīng)組織中積累類(lèi)胡蘿卜素的水平顯著提高 ， 在番茄果實(shí)中提高了 倍，擬南芥種子中 ?胡蘿卜素平均提高 43 倍，油菜種子中提高 50 倍，馬鈴薯塊莖中提高了 8 倍。研究表明八氫番茄紅素合成酶基因是類(lèi)胡蘿卜素生物合 成途徑中的限速酶。它是催化類(lèi)胡蘿卜素生物合成的一個(gè)特異性酶，可以將 2 分子的磷酸 (GGPP)催化合成第一個(gè)類(lèi)胡蘿卜素 ——八氫番茄紅素。 在番茄等模式植物上的研究表明，在上述十種酶中以 DXPS 和 PSY 最為關(guān)鍵 [20~22]。幾乎所有高等植物類(lèi)胡蘿卜素合成主鏈途徑均相同，柑桔類(lèi)也不例外?，F(xiàn)有研究表明，類(lèi)紅蘿卜素合成途徑可包括上游（八氫番茄紅素的合成）和下游（類(lèi)胡蘿卜素種類(lèi)間的轉(zhuǎn)化）途徑。例如， Ye 等 [18]與 Romer 等 [19]分別向水稻和番茄中導(dǎo)入類(lèi)胡蘿 卜素合成途徑相關(guān)基因，并未獲得預(yù)期中高水平的番茄紅素積累，卻導(dǎo)致靶器官中 ?胡蘿卜素含量增加。 近年來(lái)，包括番茄紅素和 ?胡蘿卜素在內(nèi)的植物類(lèi)胡蘿卜素代謝途徑的主要成員、關(guān)鍵酶及其基因已基本明確 [13~16]。類(lèi)胡蘿卜素是其中較為重要的植物色素，不僅參與光合作用和光保護(hù)，還賦予根、葉、花和果實(shí)等多彩的顏色，使之具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀 賞價(jià)值。 此外，我們還將紅肉蜜柚突變體與野生型 琯溪蜜柚果實(shí) PSY 基因 DNA 序列和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析 ，發(fā)現(xiàn)在 1317 bp 的編碼區(qū)內(nèi)出現(xiàn) 11 個(gè)差異位點(diǎn)， 439 個(gè)氨基酸序列中有 7 個(gè)差異位點(diǎn)，出現(xiàn)差異位點(diǎn)表 18， 19： 表 18 紅肉蜜柚和琯溪蜜柚 PSY 基因序列不一致情況分析 樣品名稱 堿基位點(diǎn) 248 352 455 613 904 969 975 994 1054 1068 1236 紅肉蜜柚 A G A G A A G G T G A 琯溪蜜柚 G A G A G T A T C A G 表 19 紅肉蜜柚和琯溪蜜柚 PSY 基因合成的氨基酸序列不一致情況分析 樣品名稱 氨基酸位點(diǎn) 83 118 152 205 302 332 352 紅肉蜜柚 G N G R G Z L 琯溪蜜柚 D D E G R Q F 5 討論 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 14 類(lèi)胡蘿卜素是生物體內(nèi)通過(guò)類(lèi)異戊二烯途徑合成而呈現(xiàn)黃色 、橙紅色和紅色的一大類(lèi)帖類(lèi)色素物質(zhì)， 類(lèi)異戊二烯是自然界中分布廣泛的一類(lèi)化合物，目前已知的類(lèi)異戊二烯化合物有 23000 多種。 （ 2） 野生型琯溪蜜柚 PSY 基因全序列 ATGTCTGTTACATTGCTGTGGGTTGTATCACCTAACTCACAATTGTCCAATTGCTTCGGGTTCGTCGATTCAGTTCGAGAGGAAAACAGGCTGTTTTATTCATCAAGATTTCTTTACCAACATCAAACCCGGACTGCTGTGTTTAATTCTAGACCTAAGCAGTTTAATAATAATAATAATAATAAGCAGAAACGGAATTCTTATCCTTTAGATACAGATTTGAGGCATCCTTGCTCATCTGGAATCGACTTGCCTGAAATATCATGTATGGTTGCTAGCACTGCTGGAGAAGTGGCCATGTCTTCAGAAGAAATGGTTTACAATGTTGTGCTCAAGCAGGCAGCCTTGGTTGATAAGCAACCAAGTGGGGTTACTCGTGATCTTGATGTGAACCCAGATATTGCTTTACCCGGAACTTTAAGTCTGCTCAGTGAAGCTTATGATCGTTGTGGAGAAGTTTGCGCCGAGTATGCTAAGACATTTTACTTGGGAACTTTGCTGATGACCCCTGAAAGGCGAAGGGCTATATGGGCTATATATGTGTGGTGTAGGAGGACAGATGAGCTCGTTGATGGGCCTAATGCTTCACACATAACTCCAACAGCTTTAGACGGGTGGGAGTCCAGGTTGGAAGACCTTTTCCGGGGTCGTCCATTTGATATGCTTGATGCTGGATTATCAGATACAGTAACCAAATTTCCTGTCGACATTCAGCCATTCAGAGATATGATAGAAGGAATGAGGATGGACCTTAGGAAGTCAAGATACAAAAACTTTGATGAATTATACTTGTATTGTTATTATGTTGCTGGGACCGTAGGGCTAATGAGTGTTCCAGTTATGGGCATAGCACCTGACTCACAGGCAACAACAGAGAGCGTCTACAATGCAGCATTGGCACTAAGGATTGCTAATCAGCTCACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAGGATGCCCAAAGAGGAAGGGTATATCTGCCACAAGATGAGTTGGCACAGGCGGGGCTTTCAGATGATGACATATTTGCTGGAGAAGTGACTAATAAATGGAGAAACTTCATGAAGAACCAGATTAAGAGGGCAAGGATGTTCTTTGATATGGCTGAGAACGGTGTGACCGAGCTGAGTGAAGCTAGTAGATGGCCGGTATGGGCTTCATTGCTGTTGTACCGGCAAATACTGGATGAGATTGAGGCCAATGATTACAACAACTTCACAAAGAGAGCTTATGTGAGTAAAGCCAAGAAGATAGCTGCACTACCAATTGCATATGCAAAATCCCTCTTACGCCCGTCAAGAATATATACCAGTAAGGCTTAA 將測(cè)序結(jié)果在 NCBI 網(wǎng)站比對(duì)，結(jié)果如表 17。 （ 1） 紅肉蜜柚果實(shí) PSY 基因全序列（紅肉蜜柚 PSY 基因進(jìn)行了兩次測(cè)序，測(cè)序結(jié)果完全一 致）： ATGTCTGTTACATTGCTGTGGGTTGTATCACCTAACTCACAATTGTCCAATTGCTTCGGGT 1 2 M 1 2 3 1300bp—— 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 11 TCGTCGATTCAGTTCGAGAGGAAAACAGGCTGTTTTATTCATCAAGATTTCTTTACCAACATCAAACCCGGACTGCTGTGTTTAATTCTAGACCTAAGCAGTTTAATAATAATAATAATAATAAGCAGAAACGGAATTCTTATCCTTTAGATACAGATTTGAGGCATCCTTGCTCATCTGGAATCGGCTTGCCTGAAATATCATGTATGGTTGCTAGCACTGCTGGAGAAGTGGCCATGTCTTCAGAAGAAATGGTTTACAATGTTGTGCTCAAGCAGGCAGCCTTGGTTAATAAGCAACCAAGTGGGGTTACTCGTGATCTTGATGTGAACCCAGATATTGCTTTACCCGGAACTTTAAGTCTGCTCAGTGAAGCTTATGATCGTTGTGGAGGAGTTTGCGCCGAGTATGCTAAGACATTTTACTTGGGAACTTTGCTGATGACCCCTGAAAGGCGAAGGGCTATATGGGCTATATATGTGTGGTGTAGGAGGACAGATGAGCTCGTTGATGGGCCTAATGCTTCACACATAACTCCAACAGCTTTAGACAGGTGGGAGTCCAGGTTGGAAGACCTTTTCCGGGGTCGTCCATTTGATATGCTTGATGCTGGATTATCAGATACAGTAACCAAATTTCCTGTCGACATTCAGCCATTCAGAGATATGATAGAAGGAATGAGGATGGACCTTAGGAAGTCAAGATACAAAAACTTTGATGAATTATACTTGTATTGTTATTATGTTGCTGGGACCGTAGGGCTAATGAGTGTTCCAGTTATGGGCATAGCACCTGACTCACAGGCAACAACAGAGAGCGTCTACAATGCAGCATTGGCACTAGGGATTGCTAATCAGCTCACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAGGATGCCCAAAGAGGAAGGGTTTATCTACCACAAGATGAGTTGGCATAGGCGGGGCTTTCAGATGATGACATATTTGCTGGAGAAGTGACTAATAAATGGAGAAACCTCATGAAGAACCAAATTAAGAGGGCAAGGATGTTCTTTGATATGGCTGAGAACGGTGTGACCGAGCTGAGTGAAGCTAGTAGATGGCCGGTATGGGCTTCATTGCTGTTGTACCGGCAAATACTGGATGAGATTGAGGCCAATGATTACAACAACTTCACAAAGAGAGCTTATGTGAGTAAGGCCAAGAAGATAGCTGCACTACCAATTGCATATGCAAAATCCCTCTTACGCCCGTCAAGAATATATACCAGTAAGGCTTAA 將測(cè)序結(jié)果在 NCBI 網(wǎng)站比對(duì)，結(jié)果如表 16。 圖 13 cDNA 二鏈電泳圖譜 注： M. marker； 1. 紅肉蜜柚； 2. 琯溪蜜柚； 3. 陰性對(duì)照 PSY 基因的克隆 琯溪蜜柚與 紅肉蜜柚 PSY PCR 結(jié)果顯示，兩者擴(kuò)增片段大小相同，均擴(kuò)增出