【正文】 引物采用 FPCRL (5’GAATTCCCCGGT。 DNA 提取方法和 第二章 相同 。 研究方法 取樣 及 DNA 提取 本文采集了從 2020 年到 2020 年在珠江口（包括香港水域）擱淺的 75 頭印度 太平洋江豚 的肌肉或皮膚樣本（圖 21） 。 由于缺乏獨(dú)立保護(hù)單元的劃分，對中國水域分布的印度 太平洋江豚的 保護(hù)工作很難進(jìn)行。 4. 進(jìn)化速率快。遵照嚴(yán)格的母系遺傳，在世代間通過母系單性傳遞，不發(fā)生重組。同一個(gè)體內(nèi) mtDNA 具有高度的均一性， 也就是說沒有組織特異性。 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 8 2. 非組織特異性。蛋白質(zhì)編碼基因間幾乎沒有間隙序列，即使存在也一般少于 10bp，僅由一到幾個(gè)核苷酸組成。其特點(diǎn)如下： 1. 結(jié)構(gòu)緊密，編碼效率高。 Dloop 環(huán)是 mtDNA 中一段長度可變的非編碼區(qū)，它是mtDNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)和控制區(qū)。 脊椎動物 mtDNA 是共價(jià)閉合的雙鏈分子，分子量較小，一般為 ~，基因組中無間隔序列，個(gè)基因間排列緊密，基因內(nèi)基本不含內(nèi)含子。 Li et al. (2020)用同樣的方法研究了黃海和渤海的沿海近岸水域分布的東亞江豚的群體結(jié)構(gòu)，也劃分了兩個(gè)獨(dú)立保護(hù)單元，分別位于 黃海北部 和黃海南部。 目前，按照物種的 分類 ，中國水域的江豚可分為三個(gè)分類單元，分別是：（ 1）從臺灣海峽到黃海和渤海的沿海近岸水域分布的東亞江豚（ N. a. sunameri） ； （ 2）在長江分布的長江江豚（ N. a asiaeorientalis）；（ 3）從臺灣海峽到南中國海的沿海近岸水域分布的印度 太平洋江豚（ N. phocaenoides）。研究 的主要結(jié)論是 劃分遺傳差異顯著的獨(dú)立保護(hù)單元 ，并提出了關(guān)于進(jìn)化模式 的假說 ， 例如 Yang et al. (2020)提出的避難所假說和 Wang et al. (2020)提出的屏障假說 ，這些假說對理解江豚物種的進(jìn)化歷程具有非常重要的意義 。 Yang et al., 2020。 Wang et al., 2020。 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 7 第 三 章 印度 太平洋江豚 的 群體 遺傳 結(jié)構(gòu)研究 前言 江豚在中國水域具有十分廣泛的分布， 以往的 研究采用了一系列的分子標(biāo)記，從 系統(tǒng)發(fā)育 地理學(xué)的角度 對不同的江豚種群在中國水域的地理分布作了研究(Chen et al., 2020。 最近的研究表明， Y 染色體 遺傳 標(biāo)記 的進(jìn)化速率比微衛(wèi)星的更快，對于進(jìn)化的群體 Y 染色體標(biāo)記比微衛(wèi)星標(biāo)記更敏感(Andrews et al., 2020)。多態(tài)性的缺乏可能是微衛(wèi)星座位的 突變率太低，不能真實(shí)地 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 6 反映核基因組的突變速率，這也可能是 本章沒有檢測到顯著水平的群體結(jié)構(gòu)的主要原因，在后續(xù)的工作中，可以增加微衛(wèi)星座位到 20 個(gè)以上，以便確認(rèn)真實(shí)的群體遺傳結(jié)構(gòu)。 本章的研究結(jié)果表明，珠江口江豚種群內(nèi)部沒有 顯著地群體遺傳分化。然而在實(shí)際的群體中，因?yàn)樯镏写嬖诖菩缘膽俚匦院托坌缘囊环蚨嗥拗片F(xiàn)象，這些因素 使得僅在母性遺傳的線粒體標(biāo)記的 Ne 反而比微衛(wèi)星標(biāo)記的 Ne 更大，因此，在檢測分化時(shí)間較近的物種時(shí)，微衛(wèi)星的作用反而更明顯 。 小結(jié)和展望 本章用微衛(wèi)星標(biāo)記研究了珠江口江豚種群的內(nèi)部群體遺傳結(jié)構(gòu)。一般 100ng/ul 的 DNA 在 25ul 的 PCR 體系中 2ul 比較合適。 而且 ，如果產(chǎn)物太濃，超出可以檢測的范圍，最后結(jié)果 可靠性會降低。為了防止假基因，最好選用物種特異性微衛(wèi)星位點(diǎn) ；（ 2） 在進(jìn)行多重 PCR 之間，需對每個(gè)微衛(wèi)星引物進(jìn)行單獨(dú) PCR 和電泳，最好在 10 個(gè)隨機(jī)樣本中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證其多態(tài)性和產(chǎn)物的大小、范圍 ，確定其在 GeneMarker 軟件中分析的圖譜形狀； （ 3）在進(jìn)行熒光標(biāo)記引物前，先用 合成 普通引物 對多態(tài)性較好的微衛(wèi)星座位進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，對產(chǎn)物進(jìn)行測序。據(jù)本人的經(jīng)驗(yàn)，在應(yīng)用中要注意以下幾點(diǎn)：（ 1） 微衛(wèi)星多重 PCR 對 微衛(wèi)星位點(diǎn)的要求較高，不僅要微衛(wèi)星位點(diǎn)的產(chǎn)物大小合適，還要每個(gè)微衛(wèi)星引物的退火溫 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 5 度在同一水平上。 多重 PCR 和微衛(wèi)星標(biāo)記相結(jié)合能顯著減少遺傳分型的 成本、 提高效率 、增加遺傳分型的準(zhǔn)確性 。 長江江豚被證實(shí)是從海洋起源，經(jīng)歷了 創(chuàng)始者事件 ，因此 遺傳多樣性 較低，而 東亞 江豚被認(rèn) 為經(jīng)歷多次分隔和雜交（避難所效應(yīng)），因此遺傳多樣性較高。在本文的比較中，長江江豚的 微衛(wèi)星座位是 13 個(gè)， 微衛(wèi)星座位來自鯨豚類的其他物種，而不是新鼠海豚屬特異性微衛(wèi)星座位， 東亞 江豚的微衛(wèi)星座位為 9 個(gè) 新鼠海豚屬特異性微衛(wèi)星座位， 而印度 太平洋江豚種群的微衛(wèi)星座位為 11 個(gè) 新鼠海豚屬特異性微衛(wèi)星座位 。在本文的比較中， 東亞 江豚種群的樣本 數(shù)量是 142，長江江豚種群的 樣本 數(shù)量是 22，而印度 太平洋江豚種群的 樣本 數(shù)量是 65。 從本文的研究 結(jié)果 看，無論是等位基因數(shù)量還是雜合度，印度 太平洋江豚都處于中等 水平，比 東亞 江豚種群低，比長江江豚種群高。等位基因數(shù)是直接描述基因豐富程度的遺傳多樣性指標(biāo)，而雜合度是基于基因頻率分布的遺傳多樣性指標(biāo)。 11 個(gè)座位上沒有發(fā)現(xiàn)偏離哈代 溫伯格平衡或連鎖不平衡現(xiàn)象， 顯示出這些特異性微衛(wèi)星座位很適合印度 太平洋江豚種群的群體遺傳學(xué)分析。 Figure 24 Results of microsatellite structure analysis of Indofinless porpoises in PRE. (1) Probability of each K range from 1 to 10。（ a）從 K=1到 K=10 的概率。盡管當(dāng) K 為 4 的時(shí)候可能性開始增高，但從 K為 2 的 Barplot 結(jié)果（圖 ）看，每個(gè)個(gè)體來自不同群體的概率相當(dāng)，因此排出了 K 大于 1 的可能性。在 11 個(gè)微衛(wèi)星座位總共發(fā)現(xiàn) 85 個(gè) 等位基因 ，每個(gè) 基因 座位上最少有 2 個(gè)，最多有 19 個(gè) 等位基因 。 STRUCTURE 的 Barplot 結(jié)果用CLUMPP (Lott et al., 2020)軟件顯示。本文 采用混合模型， 設(shè)定 K 從 1 到 10，每個(gè) K 重復(fù)計(jì)算 10 次，每次 1106 個(gè)循環(huán)，結(jié)果舍棄掉開始的 100,000 個(gè)循環(huán)的結(jié)果。每種顏色代表每個(gè)熒光標(biāo)記的 PCR 產(chǎn)物的電泳位置，橙色是 Marker Figure 22 Results of electrophoresis of the product of multiPCR. Each band of the PCR products were separated by their size from left to right. 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 1 圖 23 GeneMarker 軟件分析 的電泳結(jié)果 （ 11 個(gè)微衛(wèi)星座位 ） Figure 23 Results of electrophoresis analyzed by GeneMarker (11 microsatellite loci) 微衛(wèi)星數(shù)據(jù)分析 每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的哈代 溫伯格平衡 (HardyWeinberg equilibrium, HWE)， 連鎖不平衡 (linkage disequilibrium)， 等 位基因 數(shù) 量 (A), 期望雜合度 (HE)和實(shí)際雜合度 (HO)用 Arlequin(Excoffier et al., 2020)軟件進(jìn)行檢測， 結(jié)果的顯著性（ P 值 ）由 100,000 次 Markov 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢驗(yàn) (Engels, 2020)， 并用 Bonferroni 法 調(diào)整 其臨界水平 (Holm, 1979)。電泳結(jié)果采用 GeneMarker (SoftGeics Inc.)軟件進(jìn)行分析（圖23）。C 撫平 30 min。C 退火 30s，最后 72176。C 變性 5 min，然后是 26 個(gè)循環(huán)反應(yīng)，包括95176。 反應(yīng)體系見表 22。 每組引物的反向鏈 分別用FAM， JOE， TAMARA 和 ROX 中的一種 在 5’端進(jìn)行熒光標(biāo)記 （表 21） 。 11 對微衛(wèi)星引物按照 多重 PCR 反應(yīng)的要求，按 擴(kuò)增片段的大小 進(jìn)行分組，由于 ABI 核酸自動分析儀能同時(shí)容納五種熒光標(biāo)記，除去 Marker 外還有四種熒光標(biāo)記。總 DNA 質(zhì)量用 EB 染色的 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后 用紫外分光光度計(jì)確定 DNA 濃度?？?DNA 的提取采用傳統(tǒng)的苯酚氯仿萃取法，具體為：先加入消化液等體積的苯酚，12,000rmp 離心 1 min，吸取上清液，再加入等體積的苯酚進(jìn)行離心，如此重復(fù)萃取三次。離心管放入 5565℃的水浴鍋 2h，每隔 30 min翻轉(zhuǎn)搖勻一次。 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 17 圖 21 本研究中采集的珠江口印度 太平洋江豚樣本的擱淺區(qū)域 ，樣本的擱淺地點(diǎn)用黑點(diǎn)表示 Figure 21 Map of the approximate sampling locations in Pearl River Estuary pointed by black dots DNA 提取和 PCR 總 DNA 提取采用傳統(tǒng)的蛋白酶 K 消化加苯酚氯仿抽提法。動物的擱淺區(qū)域見圖 21。本文首次采用 11 對新鼠海豚屬特異性核微衛(wèi)星標(biāo)記，對 20202020 年珠江口（包括香港水域）擱淺的 75 頭印度 太平洋江豚進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)等分析，對此區(qū)域印度 太平洋江豚 種群 的保護(hù)和管理具有重要意義。目前多采用 ABI 遺傳分析儀對熒光標(biāo)記的 DNA片段進(jìn)行檢測，結(jié)合分子量內(nèi)標(biāo)進(jìn)行 DNA 片段長度計(jì)算，使 STR 分型變得高效快捷，結(jié)果也更加精確。 微衛(wèi)星標(biāo)記（ Microsatellite）也稱為短串聯(lián)重復(fù)序列（ STR）或簡單重復(fù)序 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 16 列（ SSR），是廣泛分布在真核生物基因組中的簡單重復(fù)序列。其次，核微衛(wèi)星標(biāo)記不需要其他信息（例如地理信息）作為假設(shè)存在群體結(jié)構(gòu)的依據(jù)。 而符合孟德爾遺傳規(guī)律的 核 微衛(wèi)星 標(biāo)記 被認(rèn)為 能克服上述缺點(diǎn) 。然而，對于在共同地區(qū)生活的物種 ，地理信息 不能作為假設(shè)的依據(jù)去計(jì)算 分化水平。 線粒體 DNA 標(biāo)記也有缺點(diǎn) 。 Mann et al., 2020)， 用線粒體 DNA 計(jì)算出的 Ne 通常比 用核 遺傳標(biāo)記 計(jì)算 的 要高 。雖然用線粒體 DNA 標(biāo)記計(jì)算的有效群體大?。?Ne）是核基因組遺傳標(biāo)記計(jì)算出的 Ne 的四分之一 (Halliburton, 2020)，但是在現(xiàn)實(shí)的群體中，因?yàn)榇菩院ｋ嗟膹?qiáng)烈的戀地性和雄性的一夫多妻現(xiàn)象 (Chesser and Baker, 1996。常見的遺傳標(biāo)記有 線粒體 DNA、 核微衛(wèi)星等。 本 研究 的 技術(shù)路線圖如下 ： 珠江口江豚和中華白海豚擱淺樣本 珠江口江豚 珠江口中華白海豚 11 個(gè)微衛(wèi)星座位 線粒體控制區(qū)分析 細(xì)胞色素 b 分析 微衛(wèi)星研發(fā) 細(xì)胞色素 b 分析 內(nèi)部群體結(jié)構(gòu) 的研究 珠江口江豚種群的 分化水平 珠江口江豚的 系統(tǒng)發(fā)育地位和分化時(shí)間 具有 多態(tài)性 的物種特異性 微衛(wèi)星PCR 引物 珠江口中華白海豚 系統(tǒng)發(fā)育地位的分化時(shí)間 其他江豚種群的240 個(gè)控制區(qū)序列 其他江豚物種的45 條細(xì)胞色素 b單倍型 其他 四個(gè) 白海豚 種群的細(xì)胞色素 b 單倍型 為珠江口江豚和中華白海豚的保護(hù)管理工作提供支持 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 14 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 15 第 二 章 珠江口印度 太平洋江豚的群體 遺傳 結(jié)構(gòu)研究 前言 群體遺傳結(jié)構(gòu)是種群不同單體型的個(gè)體的分布情況，是種群重要特征 ，反映了種群動態(tài)和演變趨勢，表現(xiàn)出種群對外界環(huán)境的適應(yīng)和響應(yīng)。 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 11 圖 12 中華白海豚（ Sousa chinensis）（馮抗抗， 2020） Figure 12 Chinese white dolphin (Sousa chinensis) (Feng, 2020) 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 12 圖 13 中華白海豚在中國水域的分布（ Jeffers