【正文】 激光掃描共聚焦顯微鏡在病理診斷中的應(yīng)用 ? 激光掃描共聚焦顯微鏡（ confocal laser scanning microscope—CLSM） 能通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)部非侵入式光學(xué)斷層對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)部進(jìn)行定位檢測，并可重建三維結(jié)構(gòu)模擬像直接對(duì)觀察對(duì)像的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。 即測量平面形態(tài)參數(shù)的 ICM；測量光密度的DNA含量分析；測量呈色反應(yīng)產(chǎn)物 （ 包括細(xì)胞化學(xué) ﹑ 免疫組織化學(xué)及原位雜交 ） 的 ICM.。 4． 實(shí)現(xiàn)質(zhì)控的均一性 （ 幾十份幾百份組織的實(shí)驗(yàn)過程的條件保持一致 ） 減少實(shí)驗(yàn)誤差 。組織芯片的廣泛應(yīng)用將會(huì)極大地促進(jìn)現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)、基因組學(xué)和蛋白組學(xué)研究的深入發(fā)展。 它是將數(shù)十個(gè)甚至數(shù)千個(gè)不同個(gè)體的組織標(biāo)本集成在一張固相載體上所形成的組織微陣列 。應(yīng)用： 細(xì)胞基因突變及微衛(wèi)星變易的研究； 細(xì)胞基因拷貝數(shù)的變化和甲基化水平的研究 定量 RTRCR. 比較基因組雜交 cDNA微陣列 分子診斷在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 ? . 腫瘤學(xué) ? . 傳染病學(xué) ? – HIV, HCV, HBC, HSV, 等 . ? . 遺傳病學(xué) ? – 確診疾病，產(chǎn)前診斷， (卵母細(xì)胞 )植前診斷 ? . 分子藥理學(xué) /藥理遺傳學(xué) ? – 新藥發(fā)明 , 療效預(yù)測 , 療效判斷 , 等 . ? . 器官 /組織移植 ? – 干細(xì)胞 , 骨髓 , 實(shí)體器官 , 等 . ? . 法醫(yī)學(xué) ? – 身份認(rèn)定，親子鑒定 , 等 . ? . 其它 分子遺傳病理在臨床上的應(yīng)用 ? 疾病的精確診斷和分類 腫瘤尤其是 癌癥 \傳染病 \遺傳病 ? . 判斷預(yù)后 ? . 預(yù)測對(duì)治療的反應(yīng) ? . 尋找治療目標(biāo) ? . 檢測殘余腫塊 (疾病 ) ? . 估價(jià)腫瘤 (疾病 )易感素質(zhì) ? . 組織分型 ? 器官 /組織移植 ? 身份認(rèn)定 \親子鑒定 分子遺傳病理在臨床上的應(yīng)用 ? . 疾病的精確診斷和分類 ? – 腫瘤，尤其是癌癥 ? – 傳染病 ? – 遺傳病 ? 最終診斷 ? . 伯基特淋巴瘤 (Burkitt’s Lymphoma) 最終診斷 ? 皮膚 T細(xì)胞淋巴瘤 ? (Cutaneous T cell Lymphoma) 分子遺傳病理在臨床上的應(yīng)用 ? . 疾病的精確診斷和分類 ? – 腫瘤，尤其是癌癥 ? – 傳染病 ? – 遺傳病 ? . 判斷預(yù)后 ? – Her2/neu擴(kuò)增 : 乳腺癌 ? – 染色體 1p和 19q缺失 : 退行型少 (寡 )樹突膠質(zhì)瘤 ? (Anaplastic oligodendroglioma) 分子遺傳病理在臨床上的應(yīng)用 ? – 抗藥性 (例如 , 金黃色葡萄球菌的 mecA基因 ) . 疾病的精確診斷和分類 – 腫瘤，尤其是癌癥 – 傳染病 – 遺傳病 . 判斷預(yù)后 . 預(yù)測對(duì)治療的反應(yīng) . 尋找治療目標(biāo) . 檢測殘余腫瘤 (疾病 ) 分子遺傳病理在臨床上的應(yīng)用 分子遺傳病理學(xué)的前景和方向 . 基因?qū)W (Genomics) – 基因表達(dá)構(gòu)象 (Gene expression profiling) / DNA 微列 (DNA microarray) / 基因芯片 (Gene Chip) ? 寡核苷酸微列 ? cDNA 微列 – 單核苷酸多形性基因組掃描 (Single nucleotide polymorphism (SNP) genome scanning) . 蛋白學(xué) (Proteinomics) – 蛋白微列 (蛋白 芯片 , Protein Chip) – 質(zhì)譜儀技術(shù) (Mass spectrometry) . 腫瘤 /組織微列 (Tumor/ Tissue Array) ? .生物芯片 ? ： 生物芯片 (biochip) 又稱為 DNA微陣列技術(shù)是 90年代中期以來影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一，生物芯片是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量核酸片段 ( 寡核苷酸、 PNA、cDNA、基因組 DNA ) 或多肽分子甚至組織切片或者細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物 (如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體 )的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī) (CCD)對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。 ? 2. 檢測外源性基因 ? ⑴ 感染基因：病毒基因 ——現(xiàn)在原位 PCR正廣泛用于HBV﹑ HIV﹑ HPV﹑ HSV等病毒性疾病的診斷及相關(guān)腫瘤的診斷及研究 。 操作簡便 ， 特異性較差 ， 容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果 ， 且擴(kuò)增效率較低 。在耐熱的 DNA聚合酶作用下反應(yīng)體系中的游離單核苷酸，在引物的引導(dǎo)下，以單鏈 DNA為模板，按 3ˊ－ 5ˊ端方向，合成出兩條新的與模板 DNA互補(bǔ)的子鏈。 多藥耐藥基因 （ multidrug resistant gene,MDR） 的表達(dá)產(chǎn)物 P170能將抗癌藥物排出細(xì)胞外 ， 通過流式細(xì)胞儀檢測可以指導(dǎo)臨床用藥 。 ⑵ 內(nèi)分泌腫瘤的功能分類 ： 腦垂體、腎上腺、胰島等 ⑶ 腫瘤組織中受體的測定 ： ER﹑ PR測定對(duì)乳腺﹑ 子宮等部位的癌瘤預(yù)后的估計(jì)和化學(xué)藥物的選擇有指導(dǎo)作用 ? (4). 組織中病毒抗原的檢測： 檢測病毒抗原來探討疾病的病因和發(fā)病機(jī)理，如對(duì) HBV的檢測來研究肝炎 ﹑ 肝硬化與肝癌的關(guān)系； EBV與鼻咽癌﹑ 非洲兒童淋巴瘤的關(guān)系； HPV病毒與宮頸癌的關(guān)系等 ? (5) 癌基因與抑癌基因蛋白表達(dá)的測定 :cerbBP5 Rb….. ? (6)腫瘤抗藥耐藥基因蛋白檢測 :MRP1\MRP3 ? (7)細(xì)胞周期蛋白： Cyclin D1\Cyclin E…… 流式細(xì)胞分析術(shù)（ flow cytometry , FCM ） ? 原理 ：將懸浮在液體中分散的細(xì)胞微粒一個(gè)一個(gè)地依次通過檢測區(qū) ， 細(xì)胞流速可達(dá) 9m/s,當(dāng)細(xì)胞通過微孔與激光呈垂直交匯時(shí)就可產(chǎn)生相應(yīng)的電脈信號(hào) ， 這些代表著多種熒光強(qiáng)度參數(shù)的電信號(hào)再經(jīng)過計(jì)算機(jī)處理 ， 得出相應(yīng)的供分析使用的點(diǎn)圖 、 直方圖和三維結(jié)構(gòu)圖 。晶體見于腺泡狀軟組織肉瘤和睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤； 黑色素小體見于惡性黑色素瘤 ﹑透明細(xì)胞肉瘤；低分化腺癌細(xì)胞間有原始腺腔或細(xì)胞內(nèi)帶微絨毛的微囊腔 (胞質(zhì)內(nèi)腺腔 )。 ? ㈡ . 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)： 肝細(xì)胞癌 ﹑ 腎上腺腫瘤及漿細(xì)胞瘤的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)最豐富 。 例如橋粒在癌細(xì)胞間通常是減少的 ， 也可異常增多 ， 或成串出現(xiàn)形成巨形橋粒 。也可在異常部位出現(xiàn)，如瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)偶爾出現(xiàn)纖毛。 ? 在病理診斷中選擇性地作電鏡檢查，對(duì)疑難腫瘤診斷 ﹑ 鑒別和探討其發(fā)生有一定幫助， 尤其是在癌和肉瘤、鱗癌與腺癌以及黑色素瘤的診斷上能起一定作用。 ? 干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化等。 用組織或單細(xì)胞用適當(dāng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察組織細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤細(xì)胞生長，細(xì)胞癌變，病毒復(fù)制，染色體變異等。如：炎癥、腫瘤、傳染病、寄生蟲 … 等 如小鼠、大鼠、兔、狗、猴、猩猩等。 診斷迅速 、 準(zhǔn)確性高 ，能夠反復(fù)檢查 。 組織不易切全而出現(xiàn)細(xì)胞空隙 ， 細(xì)胞輪廓不清晰 ， 容易出現(xiàn)組織折疊和厚薄不均 ， 染色失真等； ? ② 取材局限與取材不準(zhǔn)：一方面與手術(shù)醫(yī)生切取的組織是否包含了腫瘤實(shí)質(zhì) 、 病變組織的大小有關(guān) ， 另一方面與病理醫(yī)生肉眼判斷病變的能力和取材經(jīng)驗(yàn)有關(guān) 。 河南省腫瘤醫(yī)院 302例乳腺冰凍切片 ， 確診 292例（ %） ， 誤診 5例 （ %） ， 未確診 5例（ %） 。 ? ② 誤診：包括出現(xiàn)假陰性和假陽性 。 ③ 恒冷切片法：低溫恒冷切