【正文】 ? CLSM的主要結(jié)構(gòu)有：計算機系統(tǒng)、激光照射系統(tǒng)、顯微鏡系統(tǒng)、 XY平臺系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)等 ? 用于以下幾方面的研究： ? ① 細胞 、 組織光學切片 ， 三維圖像重建 ， 并可將重見建圖像進行旋轉(zhuǎn)觀察； ? ② 對活細胞內(nèi)酸堿度及細胞離子的動態(tài)定量測定觀察； ? ③ 、 細胞骨架的構(gòu)成 、 生物膜結(jié)構(gòu) 、 和大分子組裝等的研究； ? ④ 細胞間通訊的研究； ? ⑤ 免疫熒光的定量分析； ? ⑥ 細胞膜流動性測定和光活化技術 。有人對比流式細胞術與圖像細胞術，兩者結(jié)果相近或后者優(yōu)于前者。 ? ㈠ ．圖像（形態(tài)定量）分析技術 1．良 ﹑ 惡性腫瘤的區(qū)別上的應用 2．腫瘤的病理分級上的應用 3．參數(shù)與腫瘤預后的評價㈡．圖像細胞光度技術 （二）細胞核 DNA倍體狀態(tài)的圖像分析 ：測量 DNA 含量可作為診斷癌細胞的客觀依據(jù)。 是由二維圖形結(jié)構(gòu)信息通過數(shù)學統(tǒng)計公式的計算來推論三維結(jié)構(gòu)信息的分析法 ? 在腫瘤診斷與研究中 ， 圖像細胞術主要測量三個方面的參數(shù) 。 圖像分析技術在腫瘤病理診斷與研究中的應用 ? 病理診斷和研究一般以定性或半定量描述為主 ， 缺乏精確 ﹑ 客觀的量化指標 ， 不同觀察者之間 ， 存在一定的主觀性及誤差 ， 應用多媒體圖像分析技術進行形態(tài)測量分析 ， 使形態(tài)量化 ， 一定程度上解決了這個問題 。 2 . HE染色、免疫組織化學（ IHC）染色、原位雜交（ ISH）、熒光原位雜交（ FISH）、原位 PCR、原位RTPCR和寡核苷酸啟動的原位 DNA合成（ PRINS）等 3．減低研究成本和提高效率：將標本集成化，實行大批量流水線檢測（在 TMA上檢測幾十例、上百例腫瘤組織所花費的時間、材料如抗體、引物等，只相當于普通組織做 1~2例腫瘤組織所花費的時間和材料）。 ? 1. 研究特定基因及其所表達的蛋白質(zhì)與疾病之間的相關關系 ， 利用 TMA技術應用于腫瘤組織蛋白表達譜的研究 。 ? 可以廣泛地與核酸、蛋白質(zhì)、細胞、組織、微生物相關技術相結(jié)合，分別在基因、轉(zhuǎn)錄和表達產(chǎn)物的生物學功能這三個水平上進行研究。 組織微陣列為醫(yī)學分子生物學提供了一種高通量 、 大樣本以及快速的組織 、 細胞及分子水平的分析工具 。 ? 生物芯片 1. 基因芯片 蛋白質(zhì)芯片 ? 基本原理 : 將各種已知蛋白固定于滴定板 \濾膜 \載玻片等載體上 ,用標記了熒光素的蛋白質(zhì)與芯片作用 ,經(jīng)漂洗將未與芯片上的蛋白質(zhì)結(jié)合的成分洗去 ,再用用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術測定芯片上各點的熒光強度 ,分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關系由此達到檢測多種蛋白質(zhì)及功能的目的 . ? 應用 :診斷傳染病 \腫瘤 \遺傳病 ,信號傳導 \細胞周期調(diào)控 \細胞凋亡 \神經(jīng)生物學等 , 目的意義 ? 組織微陣列 (tissuemicroarray， TMA)也 稱作 組織芯片 ， 是新興的生物高科技技術 。 基因芯片的最大優(yōu)點在于其高通量。 基因和疾病 ? “幾乎每一種疾病都牽涉到基因” ? “ Virtually all Disease have a geic ponent” ? 引自 Francis Collins 博士 , ? 人類基因工程計劃發(fā)言人 ,美國國立衛(wèi)生實驗院人類基因研究所所長 基因變異與疾病 突變 (Mutations) 移碼突變 (Frameshift mutation) 缺失 (Deletion) 插入 (Insertion) 基因擴增 (Gene amplification) 基因轉(zhuǎn)位 (Translocation) 核苷酸非隨機重復 (Nonrandom repeat) 印刻滅活 (Imprinting) 其它 (Others) 常用分子診斷技術和方法 ? ? 基因 擴增 (放大 ) 多聚酶聯(lián)反應 (PCR)聯(lián)接酶聯(lián)反應(Ligase Chain Reaction) ? ? DNA雜交 (Hybridization) Southern 印跡法(Southern blot) ? – 免疫熒光標記原位雜交 (FISH) / 顯色原位雜交 (CISH) ? ? DNA序列測定 (Sequencing) ? 細胞遺傳學 /染色體核形分析(Cytogeics/Karyotyping) ? ? 流式 細胞儀技術 (Flow cytometry) ? . 其它方法和技術 :限制性內(nèi)切酶酶切片斷多形性 (RFLP) DNA單鏈構(gòu)象多形性 (SSCP) 比較基因組雜交 (Compartive Genomic hybridization), 色譜核形分析 (Spectral karyotype) 基因 擴增 (放大 )技術 ? –多聚酶聯(lián)反應 (PCR polymerase chain reaction , ) ? –聯(lián)接酶聯(lián)反應 (Ligase Chain Reaction) DNA雜交 (Hybridization) ? ? Southern 印跡法 (Southern blot) ? ? 免疫 熒光標記原位雜交 (FISH) ? ? 顯色原位雜交 (CISH) ? 熒光原位分子雜交染色體分析技術(cromomsome analysis by fluorescence in situ hybridization, FISH) ? 可以在同一核內(nèi)顯示兩種或多種序列，如原位雜交顯帶、基因定位、基因診斷、病毒插入基因組的檢測、基因擴增或缺是失 提高間期胞核空間位置 變化后檢測的準確性 激光顯微切割技術 ? 特點：可以獲得純的細胞群或細胞 ? 材料：石蠟包埋組織切片、冷凍切片、培養(yǎng)細胞、細胞涂片等。 細菌基因 ——用于某些細菌感染性疾病 ， 如結(jié)核病及麻風病的診斷 。 ? ⑵ 異?；蜃儺惢? ：基因突變都可以用原位 PCR來進行檢測和研究 。 2． 間接法原位 PCR ( indirect in situ PCR )：主要步驟： 標本固定 ， 目的是保持原有組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)； 滲入 ， 即讓引物 ﹑ 核苷酸和酶等反應液進入細胞內(nèi)； 原位擴增 ； 原位雜交檢測 ， 用特異性的標記探針對擴增產(chǎn)物進行原位雜交 ， 然后再根據(jù)標記分子的性質(zhì)用親和組織化學方法或免疫組織化學方法顯示其擴增信號 。 1． 直接法原位 PCR ( direct in situ PCR ): 特點是使闊增產(chǎn)物直接攜帶標記分子 。重復上述過程，可以使模板 DNA以 2 n的方式擴增（ n為循環(huán)次數(shù)）。在加熱后使 DNA雙鏈解鏈之后，用降溫的方法使兩條單鏈按堿基互補原理分別與加入的一對人工合成的寡核苷酸鏈引物結(jié)合。 分子病理學技術在病理診斷和預后中的應用 ? ㈠ ． 原位雜交（ In situ hybridization ,ISH） ：是一種將分子雜交與組織化學相結(jié)合的一項技術，它用標記的 DNA或 RNA為探針在原位檢測組織細胞內(nèi) 特定的 DNA或RNA序列。 此外還可檢測有些抑制細胞分裂作用的細胞周期蛋白 ， 如 P2 P1P1 P27等 ， 他們在細胞周期中也起著很重要的調(diào)節(jié)作用 。 ? DNA定量檢測技術及其應用 1. 癌前病變的 DNA倍體分析：異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標志，應用流式細胞分析癌前病變及不典型增生細胞的 DNA含量，可協(xié)助診斷和鑒別不典型增生和早期癌 。 等。 新技術應用 ? 一． 免疫組織化學 ? 二． 流式細胞分析術 三． 分子病理學技術 四． 圖像分析技術 五． 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 ? 免疫組化染色 免疫組織化學標記在病理診斷和臨床病理的一些應用 ⑴ 腫瘤中相關抗原的檢測 ： AFP﹑ CEA﹑ HCG、S!00 ﹑