【正文】 ● 這可以解釋，為什么在植物體細(xì)胞胚發(fā)生中，許多材料的愈傷組織誘導(dǎo)需要高濃度的 2,4D，而體細(xì)胞胚的發(fā)生則必需降低或去除 2,4D。 ● 到一定發(fā)育階段時(shí)， DNA甲基化水平又逐漸升高，胚性相關(guān)基因的表達(dá)由處于不活躍狀態(tài)，使植株發(fā)育成熟。GCm3‘ （ CPG）。 (1)蛋白質(zhì)的磷酸化影響蛋白質(zhì)因子的運(yùn)轉(zhuǎn)： ● 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄需要通過核膜進(jìn)入核內(nèi)，如果阻遏蛋白的磷酸化，則使其產(chǎn)生變構(gòu)作用而失去運(yùn)轉(zhuǎn)、結(jié)合與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的能力。 實(shí)驗(yàn)證 實(shí)， ipA具有是維持密碼和反密碼子之間的相互協(xié)調(diào) 的作用。其作 用機(jī)制可能有兩種模 式： 一是激活功能區(qū)直接與 RNA聚合 酶相互作用，從而提高其活性。 轉(zhuǎn)錄因子 DNA結(jié)合區(qū) 轉(zhuǎn)錄激活區(qū) 螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋結(jié)構(gòu) , 鋅指 (Zinc finger)結(jié)構(gòu) 亮氨酸拉鏈 (leucine zipper)結(jié)構(gòu) 酸性功能區(qū) 谷氨酰胺豐富功能區(qū) 脯氨酸豐富功能區(qū) (1) DNA結(jié)合區(qū)的類型 ① 螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋結(jié)構(gòu) 由兩個(gè)的 α螺旋通過 折疊相互 垂直連接構(gòu)成：兩個(gè)的 α螺旋 中的一個(gè)通過與磷酸作用，與 DNA形成非特異的結(jié)合；另一 個(gè)叫 識(shí)別 螺旋，與 DNA上的堿 基序列特異的接觸結(jié)合。 ● 順式作用元件 (cisacting element)的鑒出 構(gòu)建融合基因 (從轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開始的 5’ 上游區(qū)一定長度的 DNA片段與報(bào)告基因 編碼區(qū)及 3’ 末端區(qū)相連接 ) 用 ExoⅢ 外切核酸酶處理 得到 5’ 端各有不同缺失長度的融合基因 轉(zhuǎn)化植物 獲得含有上述不同缺失長度融合基因突變體的植株 用組織化學(xué)方法或其他方法 ,分析基因的 5’ 上游區(qū)缺失到什么部位就不能使 報(bào)告基因表達(dá) ,或失去正確時(shí)空表達(dá)專一性 ,或失去對(duì)脅迫因素的應(yīng)答能力。由于這些序列均與基因處于 順式位置，即在同一條 DNA鏈上 ,故冠以順式之名。其中酶 抗體偶聯(lián)物的制備是該技術(shù)的基礎(chǔ)。 從植物細(xì)胞中提取總蛋白或目的蛋白 溶解于含去污劑和還原劑的溶液中 經(jīng) SDS聚丙烯酸膠凝膠電泳，使蛋白質(zhì) 按分子量大小分離 將分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相 膜上 ,膜在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育 , 以封閉非特異性位點(diǎn) 然后加入特異抗體 (一抗 ),印跡上的目的 蛋白 (抗原 )與 l抗結(jié)合 加入能與一抗專一結(jié)合的標(biāo)記的二抗 通過二抗上標(biāo)記化合物的性質(zhì)進(jìn)行檢出 (3) ELLSA檢測(cè)技術(shù) (酶聯(lián)免疫吸附法 ) ● ELISA是一種利用免疫學(xué)原理檢測(cè)抗原、抗體的技術(shù)。 ◆ 發(fā)現(xiàn)枸杞胚性愈傷組織中有 70kD, 56kD， 32kD和一系列較小分子量 (20~26kD)的特異蛋白質(zhì)表達(dá)。體外翻譯所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)無進(jìn)一步的修飾加工過程 ,它所具有的一切特性都是編碼它的基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的修飾、加工所提供的。 （ 2） mRNA差別顯示技術(shù) 在生物體發(fā)育的不同階段，或是在不同組織或細(xì)胞 中發(fā)生的不同基因，按時(shí)間、空間進(jìn)行有序的表達(dá)方 式，叫基因的差異表達(dá) （ differential expression）。 ● 程序： 植物總 RNA的提取；探針的制備；印跡 及雜交。 36 體細(xì)胞胚發(fā)生中基因表達(dá)與調(diào)控 轉(zhuǎn)錄水平： mRNA含量 翻譯水平： 蛋白質(zhì)含量 (1)Northern雜交 (2)mRNA差別顯示技術(shù) (DDRTPCR技術(shù) ) (3) mRNA的體外翻譯 (1)蛋白質(zhì)的雙向電泳 (2)Western雜交 (3) ELLSA檢測(cè)技術(shù) (酶聯(lián)免疫吸附法 ) ● 表達(dá)與鑒定 : ● 調(diào)控 順式作用元件及其鑒出 :啟動(dòng)子、增強(qiáng)子 反式作用因子 轉(zhuǎn)錄因子 DNA結(jié)合區(qū) 轉(zhuǎn)錄激活區(qū) 螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋結(jié)構(gòu) , 鋅指 (Zinc finger)結(jié)構(gòu) 亮氨酸拉鏈 (leucine zipper)結(jié)構(gòu) 酸性功能區(qū) 谷氨酰胺豐富功能區(qū) 脯氨酸豐富功能區(qū) ； IAA、 CTK、 ABA、 2， 4D 5. DNA的甲基化對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用 一 .體細(xì)胞胚發(fā)生中特定遺傳信息的表達(dá) ： ● mRNA在細(xì)胞中的含量很低 (占總 RNA的 1%~5%), 每種特異 mRNA的含量則更少。 中心區(qū)由分裂慢、體積大的細(xì)胞組成 ,構(gòu)成了一個(gè)自我更新的干細(xì)胞庫 ,是形成莖、側(cè)生器官 (葉和花 )以及葉腋分生組織的細(xì)胞源。 （一） KNOX基因家族： Ⅰ 亞家族： 主要在植物分生組織中表達(dá)，是分生組織發(fā)生與維持所必 須的關(guān)鍵基因，調(diào)控與器官發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞分化，最終影響側(cè) 生器官的形態(tài)建成。 二 .離體培養(yǎng)中芽的起源及參與其發(fā)生的基因 （一）關(guān)于芽的起源： 源于莖尖分生組織（ shoot apical meristem, SAM）的一部分細(xì)胞并始終保持其自主性的“ detached meristem”理論（馬鈴薯）。 ● 應(yīng)答 （ mtiment）： 產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞發(fā)生特異的細(xì)胞分裂，向形成器 官原基發(fā)育。 伊貝母愈傷組織繼代培養(yǎng)對(duì)染色體變異的影響 繼代 培養(yǎng) 觀 察 變異 變異頻率 非整倍體 非整倍體 次數(shù) 天數(shù) 細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞數(shù) (%) 細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞頻率 (%) 1 43 82 52 50 3 122 112 74 74 5 203 77 53 51 7 279 85 69 66 9 427 71 63 63 167。 ◆ 寧夏枸杞葉片離體培養(yǎng)形成的再生植株根尖細(xì)胞染色體發(fā)生明顯變異。理論依據(jù)是： ◆ 只有那些未經(jīng)過畸變的細(xì)胞才有可能形成體細(xì)胞胚。 由此推測(cè) ,在胚性細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)育過程中處于相對(duì)獨(dú)立狀態(tài) ,有利于胚胎發(fā)生潛力的表達(dá)。胚性細(xì)胞開始分裂 ,從二細(xì)胞原胚到多細(xì)胞原胚始終被厚壁所包圍 ,與周圍細(xì)胞形成明顯的界限。 “ 細(xì)胞生理隔離 ” 與 “ 組織生理隔離 ” ？ ● 合子胚： ◆ 被子植物的胚囊減數(shù)分裂后 ,形成的大孢子是與周圍細(xì)胞處于分開的狀態(tài)。 預(yù)定階段 表達(dá)階段 通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分、激素組成與配比繼續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo) 二 .極性與生理隔離 “ 雙極性 (double polarity)”： 垂周分裂和平周分裂 極性分化的誘導(dǎo)因素：植物激素和外界刺激引起 不均等分裂和基因表達(dá)產(chǎn)物的不均勻分布： ● 合子在休眠期中，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都集中在一端 , 形態(tài)發(fā)生顯著的變化。這一特性是不穩(wěn)定 的。接著另一些薄壁細(xì)胞被標(biāo)記，這部分的細(xì)胞從形態(tài)上相繼轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞。 167。 GA可能對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生有負(fù)作用； (3) ABA/IAA和 ABA/GA的比值一直是 EC高于NEC，顯然豐富的內(nèi)源激素含量，可能是體細(xì)胞脫分化并形成胚性細(xì)胞和保持胚胎發(fā)生能力不可缺少的因素； (4) 補(bǔ)加適量的外源 ABA（ 4181。 ATP酶的廣泛存在和保持較高活性為胚性細(xì)胞或原胚的一系列代謝提供了能量保證。 （二）體細(xì)胞胚發(fā)生的生物化學(xué) ATPase增高并逐漸 由質(zhì)膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi) ● 推測(cè)：胚性細(xì)胞是通過外 源激素的誘導(dǎo)而啟動(dòng)的。 ?體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程與合子胚類似，第一次分裂多為不均等分裂，也有近似的均等分裂。 2. 廣泛存在著胞間連絲 (plasmodesmata)： 早期胚性細(xì)胞與周圍細(xì)胞間還存在廣泛的胞間連絲通過胞間連絲傳遞物質(zhì)和信號(hào)，為胚性細(xì)胞的進(jìn)一步分化與發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。被子植物中單子葉植物一 片子葉 , 雙子葉植物兩片子葉。 ② 克服不同步的可能方法 ◆ 提高接種物的均勻性： 在培養(yǎng)基中加入 DNA合成抑制劑 轉(zhuǎn)移培養(yǎng) 時(shí)過篩分離； 通過在含 2%蔗糖的 16%Ficoll溶液中離 心過濾 將分離物轉(zhuǎn)至無激素培養(yǎng)基上即可同步； ◆ 抑制額外或次生胚的產(chǎn)生： 使用 ABA。 胚性細(xì)胞發(fā)生具有不同步性 胚性細(xì)胞的