分離工程第六章ppt課件-wenkub.com
2024-09-18 18:20 本頁面
【正文】 已知細(xì)胞色素 C的 pI=，溶菌酶 pI=，卵清蛋白 pI=，肌紅蛋白pI=，胃蛋白酶 pI=，脲酶 pI=，血紅蛋白 pI=。 思考題：簡述疏水性相互作用層析用于蛋白質(zhì)分離的原理和操作。 特點(diǎn) ? 優(yōu)點(diǎn) ?由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作用較大，因此 HIC可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液； ?通過改變疏水配基鏈長和密度可調(diào)節(jié)吸附力，因此可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適宜的吸附劑； ?疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，價格與離子交換劑相當(dāng)。從而決定分辨和純化蛋白質(zhì)的方案。 常用的疏水性配基主要有：苯基、短鏈烷基（ C3~C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 疏水作用層析 (Hydrophobic Interaction Chromatography） Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity 操作： ? 與 IEC不同，蛋白質(zhì)的吸附在高濃度鹽溶液中進(jìn)行，洗脫則主要采用降低流動相離子強(qiáng)度的線性梯度洗脫法或逐次洗脫法。已知細(xì)胞色素 C的 pI=，溶菌酶 pI=，卵清蛋白pI=，肌紅蛋白 pI=，胃蛋白酶 pI=，脲酶pI=，血紅蛋白 pI=。 所以洗脫順序?yàn)椋何傅鞍酌浮⒁葝u素、核糖核酸酶。 pHpI帶正電荷，帶正荷 ① ③ ② 吸附性強(qiáng)， m大 ① ③ ② 洗脫順序 ： ② ③ ① 答： SephadexG100 凝膠過濾中，分子量大的物質(zhì)先被洗脫下來，凝膠過濾中的洗脫順序?yàn)椋何傅鞍酌?、核糖核酸酶、胰島素。 ? 缺點(diǎn) ?操作參數(shù)多，影響分離特性的因素非常復(fù)雜，過程設(shè)計(jì)和規(guī)模放大困難。洗脫操作參數(shù)的設(shè)計(jì)較困難。 ?特點(diǎn) ?優(yōu)點(diǎn)：流動相離子強(qiáng)度連續(xù)增大，不出現(xiàn)干擾峰，操作范圍廣； ?缺點(diǎn)：需要特殊的調(diào)配濃度梯度的設(shè)備。因?yàn)椋? ?蛋白質(zhì)的分配系數(shù)對離子強(qiáng)度非常敏感，即離子強(qiáng)度的微小改變，引起分配系數(shù)的很大變化； ?不同蛋白質(zhì)的 B值可能相差很大，即在同一離子強(qiáng)度下不同蛋白質(zhì)分配系數(shù)可能相差非常大。由于蛋白質(zhì)凈電荷數(shù)常為兩位數(shù)以上， B值很大。 ? 荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)為： ??? mIAmB其中： I為流動相的離子強(qiáng)度； A和 B為常數(shù)； m∞ 為離子強(qiáng)度無限大時溶質(zhì)的分配系數(shù)。 B、離子交換吸附蛋白質(zhì)分子會妨礙其他蛋白質(zhì)與未吸附蛋白質(zhì)離子交換基團(tuán)發(fā)生作用。 所用的基質(zhì)材料主要有纖維素，葡聚糖凝膠和瓊脂凝膠。弱酸性陽離子交換劑在 pH值減低時，離子化率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱，弱堿性離子交換劑在 pH升高時，離子化率逐漸降低，離子交換能力逐漸喪失。 還有多孔性纖維素，瓊脂糖凝膠，葡聚 糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，羥基磷灰石(層析、電泳 )。 化學(xué)吸附：吸附劑、吸附質(zhì)之間化學(xué)鍵力。 中等極性吸附樹脂 ：甲基丙烯酸酯交聯(lián)而成，交聯(lián)劑亦為甲基丙烯酸酯，故又稱脂肪族吸附劑。 吸附劑：多孔微粒。 ? 缺點(diǎn) ?選擇性低，處理量??； ?洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋。 ? 脫鹽 ?生物分離中主要用于生物大分子溶液的脫鹽及除去小分子物質(zhì)。一般用水溶性藍(lán)色葡聚糖（ 2022KD）測定。粒徑越小，分離效率越高。 凝膠特性參數(shù) ?排阻極限：不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對分子質(zhì)量。 分子篩凝膠色譜原理 二、凝膠過濾介質(zhì) 對凝膠過濾介質(zhì)的要求 ? 親水性高，表面惰性，即與溶質(zhì)不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用； ? 穩(wěn)定性高，對 pH、離子強(qiáng)度及化學(xué)試劑穩(wěn)定，使用壽命長； ? 具有一定的孔徑分布范圍； ? 機(jī)械強(qiáng)度高，允許較高的操作壓力。 采用梯度洗脫（階梯式洗脫）： 洗脫劑的洗脫能力可以連續(xù)或分段的提高。 色譜峰呈階梯式 頂替展開 利用一種吸附力比各被吸附組分都強(qiáng)的物質(zhì)來洗脫，這種物質(zhì)稱為頂替劑。 二、分類 流動相與固定相 ???????????????????超臨界流體固定相層以固體為載體的液體薄液體固體液相氣相流動相固定相的形狀 ?????柱層析薄層層析紙層析?用于大量制備分離多用于分析???壓力 ? 以固體為固定相的液相柱層析中，根據(jù)操作壓力的不同分為： 流動相流動
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