細(xì)胞工程第4章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程-wenkub.com
2024-08-30 17:34 本頁(yè)面
【正文】 基因的轉(zhuǎn)移可通過物理或化學(xué)的方 法，也可通過各種病毒或非病毒載體的介導(dǎo)， 還可通過改造細(xì)胞（造血干細(xì)胞、成纖維細(xì) 胞、骨髓肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞）進(jìn)行 細(xì)胞治療。然后，活細(xì)胞這種自身固有的代謝網(wǎng) 絡(luò)相對(duì)實(shí)際應(yīng)用而言，其遺傳特性并非最 佳，需要對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾； B、代謝控制發(fā)酵 （ metabolic control fermentetion） —— 是指利用遺傳學(xué)或生物化學(xué)方法，人 為地在 DNA分子水平上改變和控制微生物 的代謝，使目的產(chǎn)物大量的生成、積累的 發(fā)酵； C、在代謝控制發(fā)酵的理論 基礎(chǔ)上，提出 和形成了“代謝工程”概念； D、代謝工程 （也稱途徑工程， pathway engineering） —— 是指應(yīng)用重組 DNA技術(shù)和分析生物學(xué)相關(guān)的 遺傳學(xué)手段進(jìn)行有精確目標(biāo)的遺傳操作，改變酶 的功能和輸送體系的功能，甚至改變產(chǎn)能系統(tǒng)的 功能，以改變細(xì)胞某些方面代謝活性的整套工作 （包括代謝分析、代謝設(shè)計(jì)、遺傳操作和目的代 謝活性的實(shí)現(xiàn)）；即是指生物化學(xué)反應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò) 有目的地被修飾。 ● 用重組技術(shù)或細(xì)胞融合技術(shù)建立的工程 細(xì)胞系，在進(jìn)行無(wú)血清懸浮培養(yǎng)或高密度 培養(yǎng)時(shí)，都需經(jīng)過一定時(shí)間的細(xì)胞適應(yīng)能 力馴化； ● 細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)條件的適應(yīng)能力和生 長(zhǎng)形式的馴化 ， 對(duì)于建立優(yōu)化的無(wú)血清高 密度培養(yǎng)工藝非常重要； ● 通過馴化期可以逐漸修復(fù)那些不適應(yīng)的細(xì)胞群 體 ， 在馴化過程中監(jiān)控并篩選那些具有優(yōu)化性能 特性 （ 如細(xì)胞生長(zhǎng)率 、 產(chǎn)出率 、 細(xì)胞死亡率 、 基 因穩(wěn)定性等 ） 的細(xì)胞克隆或細(xì)胞群； ●懸浮培養(yǎng) 無(wú)血清培養(yǎng)條件的馴化 的馴化 高細(xì)胞密度培養(yǎng)的馴化 主要包括 （時(shí)間、難度不一） 貼壁生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化為懸浮生長(zhǎng)的馴化 B、貼壁培養(yǎng) （ anchoragedependent culture） —— 是指讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上進(jìn)行增殖的培養(yǎng) 方法。 ● 微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞損傷 —— 微載體湍流渦旋 相互作用是主要因素； ● 懸浮細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的細(xì)胞損傷 —— 鼓泡式、氣升 式相對(duì)溫和，決定于 氣泡聚并與破裂速率 ； ● 防止細(xì)胞機(jī)械破裂的培養(yǎng)液成分 —— 4． 4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝 ● 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝是指動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)生物技術(shù)產(chǎn)品的 生產(chǎn)工藝； ● 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品的種類繁多 ， 生物合成各具特點(diǎn) ， 其培養(yǎng)工藝過程也不同； ● 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝的設(shè)計(jì)要根據(jù)細(xì)胞本身的生長(zhǎng)特點(diǎn) 、 生長(zhǎng)形式 、 目標(biāo)產(chǎn)品的表達(dá)量 、 穩(wěn)定性等進(jìn)行綜合考慮 ， 以選擇相應(yīng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng) ， 確定培養(yǎng)條件 、 培養(yǎng)環(huán) 境和各種參數(shù)控制指標(biāo)等； 目前，成熟的蛋白治療藥物生產(chǎn)工藝有： 流加培養(yǎng)工 藝、灌注培養(yǎng)工藝、批式培養(yǎng)工藝和反復(fù)批式培養(yǎng)工藝 。min—— 液體中最低氧濃度 。 4． 3 培養(yǎng)液與培養(yǎng)環(huán)境 4． 3． 1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件 4． 3． 2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液和添加劑 4． 3． 3 無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng) 優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)組分明確 ， 批次間重復(fù)性 好 ， 易檢測(cè) ， 適合特定過程； 缺點(diǎn)：比較貴 ， 針對(duì)性強(qiáng) 。 bu 4． 2． 5 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞代謝工程優(yōu)化改造 A、 原因： 與原核細(xì)胞 、 酵母細(xì)胞 、 昆蟲細(xì) 胞相比 ， 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的外源蛋白質(zhì)最接近 天然構(gòu)想 ， 其生物自身的生長(zhǎng)代謝特性并非 最佳 ， 為提高培養(yǎng)細(xì)胞活性和單位細(xì)胞的產(chǎn) 率 ， 延長(zhǎng)培養(yǎng)周期 ， 必須采用代謝工程方法 優(yōu)化改選宿主細(xì)胞 ， 對(duì)細(xì)胞自身的遺傳特性 進(jìn)行功利性修飾 。 C、中國(guó)與美國(guó)動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)比較（見表） 中國(guó) ， 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模 流加工藝：產(chǎn)量高易放大 、 操作簡(jiǎn)單 ， 美國(guó) ， 產(chǎn)業(yè) 如 Genentech、 IDEC、 化規(guī)模生產(chǎn) MedImmune、 Merk公司 ， 蛋白質(zhì)公司 連續(xù)灌注工藝：適合不穩(wěn)定產(chǎn)品 、 培養(yǎng)利用低 、 操作復(fù)雜 、 產(chǎn)品回收大 ， 如： Genzyme、 Geic Institute、 Bayer公司 中 國(guó) 美 國(guó) 批式培養(yǎng)（ batch） 2100L 中試規(guī)模 產(chǎn)業(yè)化手段； 12022L工業(yè)反應(yīng)器 流加培養(yǎng)（ fed batch） 5500L 中試規(guī)模 產(chǎn)業(yè)化手段； 12022L工業(yè)反應(yīng)器 灌注培養(yǎng)（ perfusion） 530L 中試規(guī)模 產(chǎn)業(yè)化手段； 12022L工業(yè)反應(yīng)器 D、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程技術(shù)是當(dāng)今生物制藥領(lǐng)域最重要 的關(guān)鍵技術(shù)之一； （ 10000L規(guī)模 、 g/L級(jí) ） E、 大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)中還存在問題需要解決： 去除培養(yǎng)環(huán)境中外源因子的污染 在線檢測(cè)與工藝控制 ， 如 O2限定與溶解 CO2嘗試?yán)? 積的控制新細(xì)胞生物反應(yīng)器系統(tǒng)的開發(fā)利用 4． 2 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞系 4． 2． 1 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞發(fā)展： 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞 —— 是指按生產(chǎn)條件 選擇 、 馴化 ， 適于大量培養(yǎng) ， 用于生產(chǎn)制備生 物制品的動(dòng)物細(xì)胞 。它依托三 部分技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（基礎(chǔ)）、生化工程技術(shù) （過
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