【正文】 不同濃度下ELP[KV8F20]相變溫度Fig Different concentrations ELP[KV8F20] corresponding to different 3: total proteins after induction。兩輪ITC之后，與細胞破碎液相比，目的蛋白質(zhì)在純化的過程中并沒有太大損失，因而可認為ITC可以保證目的蛋白較高的回收率。之后，將該pET22 bELPs導(dǎo)入到E. coli BL21 (DE3)宿主菌中，構(gòu)建工程菌。于4000 r/min，離心10 min收集菌體，分別收集胞外、胞內(nèi)粗酶液。將冷凍干燥后的 ELPs溶解于鹽濃度中，ELPs的終濃度為25 μM，并測定其在 A350處不同溫度下的濁度。，即：測定 10176。（4）用容器盛大量的超純水，將透析袋完全浸泡在超純水中進行透析，每隔3 h換一次超純水。 (6)在使用之前要用蒸餾水將透析袋里外加以清洗。(3)將透析袋用蒸餾水徹底漂洗。（5）根據(jù)所得數(shù)據(jù)制作L色氨酸的OD280標(biāo)準(zhǔn)曲線采用紫外分光光計測定Trp 的在280 nm 處的消光系數(shù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）稀釋，用移液槍取10 ml的10 mmol/L色氨酸溶液，用去離子水定容于100 ml容量瓶，制成1mmol/L色氨酸溶液。取50μL菌液轉(zhuǎn)接到含Amp（終濃度為100 μg/ mL）的新鮮TB培養(yǎng)基中，37℃下250 ，加入IPTG誘導(dǎo)（終濃度為1 mM），誘導(dǎo)4小時，4 ℃，4000 rpm離心15 min，收獲菌體，用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸菌體，然后置冰浴中超聲破菌(超聲2 s，間隔2 s，共4 min)。L甘油對菌種進行保存，置于－70℃冰箱中。L IPTG) ，在室溫下放置2030 min，待溶液被充分吸收后，倒置于37℃培養(yǎng)1216 h，通過觀察平板上的細菌菌落可以初步確定含有重組質(zhì)粒的菌落，還需通過質(zhì)粒單雙酶切和基因測序來進一步鑒定。L，37℃下600rpm培養(yǎng)1h，使細胞復(fù)蘇；(4) 取100181。L LB培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入5mL 新鮮LB中，37℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（~，一般3 ~4 h）；(3) mL菌液置于離心管，冰浴10 min，再于4℃下4000 rpm離心10 min，棄上清液；(4) 取1 mL 100 mM冰冷的CaCl2溶液加入離心管，振蕩使菌體懸浮，接著冰浴30 min，再于4℃、4000 rpm離心10 min，棄上清液；(5) 將100 μL 100 mM預(yù)冷的CaCl2溶液加入離心管，使菌體懸浮，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?4~48 h內(nèi)轉(zhuǎn)化為佳。（7）4mol/LNaCl溶液： g NaCl，溶解，定容于1000ml的容量瓶。(3) 20mg/mL X－Gal：稱取20mgX－Gal溶于1mL二甲基甲酰胺中，?20℃避光保存。 藥品名產(chǎn)地規(guī)格丙三醇氨芐青霉素IPTG蛋白胨酵母提取物聚乙烯亞胺氯化鉀（KCl）氯化鈉（NaCl）磷酸氫二鉀磷酸二氫鉀磷酸二氫鈉廣東汕頭市西隴化工有限公司上海捷瑞公司BBI公司OXOID公司OXOID公司sigma公司廣東汕頭市西隴化工有限公司廣東汕頭市西隴化工有限公司廣東汕頭市西隴化工有限公司廣東汕頭市西隴化工有限公司廣東汕頭市西隴化工有限公司分析純（AR）分析純（AR）分析純（AR） 純度99%純度99%分析純（AR） 分析純（AR）分析純（AR）分析純（AR）分析純（AR）分析純（AR）電泳儀EC25090、移液槍、常溫離心機和超速低溫冷凍離心機均購自Thermo公司；水凈化系統(tǒng)（Millipore 公司）；熱電微型恒溫器（eppendorf 公司）；電子天平（MP200B型 雙圈牌）；電熱恒溫水浴鍋（DKS24型 上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG9070型 上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；旋渦混合器（HQ60 北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司）；微波爐（格蘭仕）；生化培養(yǎng)箱（SHP150型 上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；超聲波細胞破碎儀（JY92Ⅱ型 寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司）；恒溫培養(yǎng)搖床（ZHYW100B型 上海智城生化儀器公司）；凝膠成像系統(tǒng)Gis2008（上海天能科技有限公司）；756型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。以上培養(yǎng)基均為121℃，滅菌20min。TAAGGCAGC表達質(zhì)粒pET22b(+)的修飾及重組表達質(zhì)粒pET ELP[KV8F20]。E. coli BL21(DE3)是噬菌體DE3的溶原菌。其設(shè)計原理參考文獻[56]?；贑hou 提出的偽氨基酸概念，考慮了ELPs的氨基酸組成極為相似，構(gòu)造了一種 維的偽氨基酸組成來表示蛋白質(zhì)序列，最小中位方差回歸、支持向量機、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)被用來作為預(yù)測的工具，結(jié)果表明當(dāng)=8為氨基酸相關(guān)系數(shù)的階數(shù)最佳運行參數(shù)，而使用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所建立的相變溫度預(yù)測模型為最佳。：神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)運行參數(shù)的選擇Table :Selection of running parameters of BP neural networkNumberThe learning rateMomentum parameterThe neuron numbers of the hidden layerMAEMSEMPAE%N18N210N313N417N55N611N715N83N96default6用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立的相變溫度模型，通過該模型對實際測得的數(shù)據(jù)進行預(yù)測，此線性回歸方程是為：。：使用支持向量機獲得的預(yù)測值與實測值關(guān)系Fig2: 　Relationship between experimental and predicted transition temperature obtained by SVM對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)而言，由于訓(xùn)練樣本集的大小有限，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練后對訓(xùn)練集外的輸入的響應(yīng)如何，直接決定了網(wǎng)絡(luò)的性能。如前所述，=8為氨基酸相關(guān)系數(shù)的階數(shù)最佳運行參數(shù)，利用UD對支持向量機運行參數(shù)進行優(yōu)化，經(jīng)交叉驗證后，：：支持向量機運行參數(shù)的選擇Table : Selection of running parameters of SVMNumberCepsilonGammaMAEMSEMPAER1105R21R3R41R550000R6R7100R810000R950R10R11R125R135001R145000R151000default1，三個誤差特征指標(biāo)在交叉驗證中變化的幅度較小，這說明SVM對運行的參數(shù)不是很敏感。而ELPs濃度對ELPs相變溫度沒有影響，故為相關(guān)系數(shù)零。使用的PC為DELL precisionTM490。為了定量比較擬合和測試效果，特定義以下三個特征指標(biāo):(1) 平均絕對百分比誤差：（2）均方根誤差：（3）平均絕對誤差：式中， 和 分別表示實際值和擬合值(或預(yù)測值) 。 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是由大量的神經(jīng)元廣泛互連而成的網(wǎng)絡(luò)，是模擬人在思維時神經(jīng)元的工作原理而形成的一個非線性的動力系統(tǒng)，BP 網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)采用梯度下降算法，使得網(wǎng)絡(luò)的實際輸出與期望輸出的均方差極小化，且具有自適應(yīng)機制，通過訓(xùn)練和學(xué)習(xí)，達到對知識進行分類、模式判別、聯(lián)想記憶等能力[52]。文中所用的數(shù)據(jù)取自于Olson S D 的博士論文[48]，文獻數(shù)據(jù)表格中所涉及到的參變量有ELPs的分子量(MW)、ELP每一單體的Xaa數(shù)量(Kperiod)、ELPs的濃度([ELP])。在這之前，Urry等認為，是關(guān)于ELPs序列、多肽鏈長度、Xaa種類及mole fraction的函數(shù) [47]， 然而，Chilkoti等[16]認為Urry等合成的ELPs大多是依賴于化學(xué)法，因而ELPs的長度就不能得到精確控制，故不能很好地描述ELPs序列，鏈長及濃度與的內(nèi)在關(guān)系。利用ELPs融合蛋白也具有可逆相變的特性，使用采用ITC（inverse transition cycling）純化ELPs的重組蛋白具有簡單、快速等優(yōu)點。模擬結(jié)果分析主要分析了RMSD值、氫鍵等，通過這些結(jié)果推測ELPs的熱穩(wěn)定性及分析ELPs相變機理。運行模擬是為了分析分子中所有原子在微觀上的相互作用關(guān)系與特性，并從中分析出相應(yīng)的宏觀性質(zhì)[44]。是指在一定的宏觀條件下(約束條件)，大量性質(zhì)和結(jié)構(gòu)完全相同的、處于各種運動狀態(tài)的、各自獨立的系統(tǒng)的集合。由于ELPs具有很好的機械性能及特殊的生物活性，自組裝的 ELPs可以生成微管與納米管結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。對響應(yīng)型組裝納米級微粒來說，環(huán)境響應(yīng)型藥物載體的發(fā)展需要在制備方法上有新突破。 在構(gòu)造藥物載體微粒上應(yīng)用Fujita等[40]通過一系列方法使ELPs與聚天冬氨酸融合，成功構(gòu)造出一種均一且有理想相變溫度的微粒(PGVGV)120D176，這種物質(zhì)只在生理條件下（pH=，37℃）才能形成球狀的微粒，而在相似的條件下如36℃不能形成微粒，且該微粒內(nèi)部為疏水性，易于在其內(nèi)部導(dǎo)入一些疏水性小分子藥物。過去幾十年中，利用 ELPs作為可溶性載體并應(yīng)用于靶向腫瘤，眾多學(xué)者作了大量研究。從上述報道可見，ELPs通過凝聚能產(chǎn)生穩(wěn)定性較好的 ELPs水凝膠，在組織工程有巨大潛力。n等[26]研究表明ELPs的水凝膠可促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞固定，并且人臍靜脈內(nèi)皮細胞易于滲透到多孔ELPs水膠體中。ELPs的水凝膠體已成功應(yīng)用于軟骨、椎骨的組織修復(fù)，血管的移植，膀胱干細胞基體神經(jīng)引導(dǎo)干細胞薄片及手術(shù)后的傷口治愈[2]。注射之后，ELPs可迅速形成一種水凝膠，這種水凝膠可作為三維人工胞外基質(zhì)，以提供有完整結(jié)構(gòu)及功能的外植細胞，外植細胞可用來組織修復(fù)。ELPs在水溶液中具有良好的生物相容性；在體內(nèi)有很好的生物適應(yīng)性；且可在體內(nèi)降解成氨基酸，這些氨基酸可在體內(nèi)進行代謝；此外ELPs基本無毒、無免疫反應(yīng)、不會產(chǎn)生炎癥等 [2]。 ELPs在組織工程上應(yīng)用 ELPs本身具有良好的生物相容性、可在體內(nèi)進行自然降解成氨基酸、無毒、且可通過基因工程進行高通量生產(chǎn)等優(yōu)勢。當(dāng)加熱到 30–40176。當(dāng) ELPs與目標(biāo)蛋白進行融合表達， ELPs融合蛋白也有可逆階段，這使得通過 ITC開發(fā)一種非層析法來純化融合蛋白成為可能。（C）分別用RE1與RE2的限制性內(nèi)切酶酶切含有ELPs基因的克隆載體，產(chǎn)生含有RE1與RE2酶切后粘性末端的片段；用RE1酶切含有ELPs克隆載體，產(chǎn)生線性克隆載體。使用基因重組合成法，并通過一系列條件優(yōu)化后，[17]。 ELPs合成方式主要有兩種：一種是化學(xué)法，另一是基因重組合成法，后者為目前主流方法。 pH對Tt的影響Girotti A等[16]通過實驗表明，在相同 ELPs濃度下，ELPs[(VPGVG)2VPGEG(VPGVG)2]n（n分別為 5，9，15，30，45），它們的均顯示出相同的趨勢：當(dāng)?shù)陀谀骋粋€給定的 pH時，值幾乎保持常數(shù)，當(dāng)高于這一特定的PH值時，就迅速增加。 分子量對 ELPs的 Tt影響Girotti A等[16]對一系列的 ELPs模型進行研究時發(fā)現(xiàn)，隨著分子量下降，ELPs的卻逐漸上升。 鹽濃度對Tt的影響對于所有的 ELPs，均隨 NaCl濃度增加而下降。即 ， 代表斜率，ELPs單體不同，其值也不相同，為ELP濃度。從能量變化角度來看，相變過程是一個復(fù)雜多步的轉(zhuǎn)變，在該轉(zhuǎn)變過程中，某些步驟是吸熱的，這可能與疏水性水合作用的損耗有關(guān)；而其它步驟均是放熱的，結(jié)果導(dǎo)致 ELPs多肽鏈以物理方式（范德華力）聚集在一起，但在這一過程中ELPs放熱組份數(shù)量還不及吸熱組份數(shù)量三分之一[12]。Dybal [7]認為發(fā)生相變時，在Pro與Val殘基處會形成β(II)轉(zhuǎn)角；但Gross [8]等認為，在整個相變的過程中，聚合五肽(GVGVP)n并不存在β螺旋構(gòu)像，而β折疊（β sheets）則是其最基本的規(guī)則構(gòu)象（the basic regular part of conformation）；Serrano等[9]研究表明升高溫度會使得β螺旋聚集在一起，在1℃的相變溫度范圍內(nèi)，他們觀測到有25％的氨基酸在鏈內(nèi)形成了β折疊。ELPs有一個可逆相變過程，稱之為反轉(zhuǎn)變溫度（inverse temperature transition，ITT），若環(huán)境溫度低于該相變溫度（transition temperature，），該多肽在水溶液中為高度可溶，聚合物鏈保持無序結(jié)構(gòu)，且相當(dāng)伸展。 ELP[KV8F20] had undergone phase transition at the 350K and suffered from denaturalization at 375 K when the ELP[KV8F20] was in 1M NaCl solutions. We believed that hydrophobic collapse and decreasing quantity of binational water played a k