【正文】 9．從工具板中選擇直方圖，選擇文件，確認(rèn)選擇 Manual Scale（設(shè)置為 50） 10．選擇 FL2為參數(shù)，選擇 T lymphocyte Gate，點(diǎn)擊 OK 11．從工具板中選擇直方圖 Marker，畫 M1：陰性細(xì)胞；畫 M2：陽性細(xì)胞。 或用括號(hào)表示 Not R1 and R2：正確 （所有不在 R1且在 R2 內(nèi)的細(xì)胞） R1 and Not R2：正確 （所有不在 R2且在 R1 內(nèi)的細(xì)胞） R1 Not R2：錯(cuò)誤 Not （ R1 and R2）：正確 （所有在 R1和 R2 交集以外的細(xì)胞） R1 or R2 and R3：正確 （所有在 R2和 R3交集內(nèi)或在 R1 內(nèi)的細(xì)胞） （ R1 or R2） and R3：正確 （ 所有在 R1或 R2內(nèi)且在在 R3內(nèi)的細(xì)胞 ） R1 or G2 or Not R3 and R4：正確 （ 首先 not R3，然后 and R4，其次或 R1或 R2內(nèi)的細(xì)胞） （ R1 or G2 or Not R3） and R4：正確 （首先括號(hào)內(nèi)，然后 and R4） 3．在不同文件之間可拷貝 Region，但無法拷貝 Gate。 R1 or R2（或 R1+R2）： 在 R1內(nèi)或 R2內(nèi)的細(xì)胞都滿足該門的要求 。 3．此時(shí) 在 FL3/SSC上在嗜堿粒細(xì)胞群顯示銹色。 4．從 Gate 菜單中選擇 Gate list，為 G1選擇黃色，關(guān)閉此對(duì)話框，可見淋巴細(xì)胞呈黃色。在熒光 圖上畫一Region，用該 Region在另一圖（常常是 FSC/SSC）上的位置。 5． 12． 4 門 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 24 門由一個(gè)或多個(gè) Region組合而成。 刪除 Region： 在點(diǎn)圖上選擇 Region，然后撳 DEL鍵或從 Edit 菜單中選擇 clear即可。 重新定位頂點(diǎn)： 改變多邊形 Region的一種方法。 5． 12． 2 改變 Region 必須首先選擇 Region（在 Region邊界上任何處點(diǎn)擊），然后才能改。 5．從 File 菜單選擇 Quit 5． 12 Regions 和 Gating（畫 門） Region是將某一群體細(xì)胞區(qū)分開以分析或分選。 1．從 Apple 菜單中選擇 Microsoft Excel，一張空白表格將出現(xiàn)。 3．在右下角選擇 stationery pad。 1．點(diǎn)擊點(diǎn)圖，從 Plot 菜單中選擇 Format dot plot，出現(xiàn)點(diǎn)圖對(duì)話框，選擇 No file，點(diǎn)擊 OK。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 22 2． 在 Plot and Stats to Process框中選擇 ALL 在 Pause after each file increment 框中選擇 for seconds，輸入 5 選擇 Print after each file increment 選擇 Export Statistic—new file（選擇或創(chuàng)建目錄及文件名） 選擇 File increment ： 1 3．點(diǎn)擊 OK，從 Batch菜單中選擇 RUN，出現(xiàn) Batch Control框。 2． 垂直或水平點(diǎn)擊鄰近的空白四邊形，點(diǎn)擊 OK，文件成 2頁。 2. 使該點(diǎn)圖處于激活狀態(tài)，從 Status 菜單中選擇 Quadrant Stats（象限統(tǒng) 計(jì)）。當(dāng) CD45/SSC作圖時(shí)，淋巴細(xì)胞可與溶解的紅細(xì)胞、碎片、嗜堿粒細(xì)胞很好地區(qū)分開來。 5． 11 實(shí)驗(yàn)練習(xí)：數(shù)據(jù)分析 在每管中增加第二、三、四色可增加獲得的信息并降低獲取的管數(shù)。 2．點(diǎn)擊 open，出現(xiàn)文件打開對(duì)話框，選擇文件目錄及文件名，點(diǎn)擊 open。 2．點(diǎn)擊 save，出現(xiàn)文件保存對(duì)話框，選擇文件目錄及文件名，點(diǎn)擊 save。 5． 9 儲(chǔ)存、恢復(fù) 儀器設(shè)置 優(yōu)化后的儀器設(shè)置條件可儲(chǔ)存以備以后重新設(shè)置和打印。 5．點(diǎn)擊 Acqusition Control窗口 中 Acquire 6．該管獲取完后，會(huì)出現(xiàn)“嘟”聲，然后插上下一管（在 Reagent Panel中也為第 二管） 7．重復(fù) 56步，直到 Reagent Panel中最后一管。 1．從 Acquire 菜單中選擇 Counter，出現(xiàn) Counter計(jì)數(shù)框。 3色 Panel： 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP CD3FITC/CD16+56PE/CD45PerCP 4色 Panel： 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP/CD4APC CD3FITC/ CD16+56PE/CD45PerCP/CD19APC 1． 從 Acquire 菜單中選擇 Edit Panel，出現(xiàn) Edit Panel對(duì)話框 2．點(diǎn)擊 Panel 上的 Add， new panel 就出現(xiàn)在 Panel list 中，輸入 panel 名 3．選擇該 panel（變黑），點(diǎn)擊 Tube 上的 Add， Tube1就出現(xiàn)在 tube list 中，輸入 tube 名 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 17 4．選擇該 tube（變黑），在 label list 中為該管選擇參數(shù)名： 如： P1： FSC P2： SSC P3：小鼠 IgG1FITC P4：小鼠 IgG1PE P5： CD45PerCP P7：小鼠 IgG1APC（若 4色） 5．點(diǎn)擊 Tube 上的 Add， Tube2就出現(xiàn)在 tube list 中，輸入 tube 名（如： 3/8/45） 6．重復(fù)第 4步。 輸入：在 P1后的空格中輸入?yún)?shù)名。 3．點(diǎn)擊此對(duì)話框的 Select “ ”。若 3 色分析， FSCH、 SSCH、 FL1H、 FL2H、 FL3H需儲(chǔ)存。 Storage窗口 2．在 Acquisition Gate 中選擇默認(rèn)設(shè)置： Accept 、 All 獲取的數(shù)據(jù)首先由獲取的門處理，落在門內(nèi)的所有顆粒被接受或放棄。 Storage 窗口 在此窗口可設(shè)定獲取和儲(chǔ)存的顆粒數(shù)及類型。 16．移去樣本管，插 上雙蒸水管。 12．移去此管，插上小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/CD4 APC管。 8．若必要，調(diào)節(jié) FL3%FL2使 PE+細(xì)胞在 FL3/FL2點(diǎn)圖的左上象限 9．移去此管，插上小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC管。 4．若必要，調(diào) 節(jié) FL2%FL1使 FITC+細(xì)胞在 FL1/FL2點(diǎn)圖的右下象限。 補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)依賴于由同型對(duì)照管設(shè)定的探測(cè)器電壓。若 4色樣本，必要時(shí)需也要調(diào)節(jié) FL3%FL4， FL4%FL3 。 16．點(diǎn)擊 Aqusition Control窗口中的 Pause。 12．插上同型對(duì)照管 13．點(diǎn)擊 Aqusition Control窗口中的 Restart。 8．在工具板中選擇象限標(biāo)尺 ,在 FL1/FL2點(diǎn)圖上 以同型對(duì)照管的門內(nèi)細(xì)胞畫象限 , 這些象限指定了陰性 /陽性區(qū)域。如獲取 4色樣本，進(jìn)行下一步。這和自發(fā)熒光 都是背景熒光。若必要，將這群細(xì)胞調(diào)在所有圖的左下角。 1． 在工具板中選擇多邊形的 Region。調(diào)節(jié) FSC閾值是為了去除碎片和噪音。出現(xiàn) Threshold 窗口。 13. 從 Cytometer菜單中選擇 Detectors/Amps。出現(xiàn) FSC/SSC點(diǎn)圖。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 9 Plot source(點(diǎn)圖來源 ),選擇 aqusition(獲取 )。將文件增至二頁。 1. 先開儀器后開計(jì)算機(jī)，以確保儀器和計(jì)算機(jī)之間的正常通訊。 CD3FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC。 ? 調(diào)節(jié) FSC、 SSC探測(cè)器和 FSC閾值 ? 畫淋巴細(xì)胞門 ? 調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償 FACSComp用