血紅蛋白的提取和分離(1)-wenkub.com
2025-05-23 18:25 本頁面
【正文】 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出； 如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。 三、實驗結果分析與評價 你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？ 你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？ 由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到 血紅蛋白溶液 ，即 :樣品的處理；再經過透析去除分子量較小的雜質，即樣品的粗分離；然后 通過凝膠色譜法 將相對分子質量較大的 雜質蛋白除去 ，即 :樣品的純化；最后經 聚丙烯酰胺凝膠電泳 進行純度鑒定。 收集得到的純化后的蛋白 思考下面的問題： 讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的 pH范圍內，維持結構和功能。 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。 ④洗脫： 小心加入 pH= 的 20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。 不能發(fā)生洗脫液流干， 露出凝膠顆粒的現(xiàn)象 。 注意： 凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水 。④組裝： 將上述三者按相應位臵組裝成一個整體 。 透析過程動畫演示 利用透析袋透析 凝膠色譜操作 : （ 1）凝膠色譜柱的制作： ① 取長 40厘米，內徑 ， 兩端需用砂紙磨平。 ③分離： 用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜臵片刻后，分出下層的 紅色透明液體 。 低速離心（低速短時間） 重復 5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色 ，表明洗滌干凈。 (1)紅細胞的洗滌 : ① 洗滌目的 : 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的 分離純化， 洗滌次數(shù)不可過少 。 市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售。由幾條肽鏈組成的 蛋白質復合體 在 SDS的作用下會 解聚成單條肽鏈 ，因此測定的結果只是 單條肽鏈的分子量 。 聚丙稀酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N,N甲叉雙丙烯酰胺在 引發(fā)劑 和 催化劑 的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網狀結構的凝膠。 ②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。 : : 通常由 1－ 2 種緩沖劑 溶解于水 中配制而成。 相對分子質量不同 的蛋白質分子因此得以分離。
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