【正文】 色譜譜見圖 43。 ? ③ 精密度：取上述標準血漿 ， 按標準曲線項下方法處理 、 進樣 ， 連續(xù)測定 5次 ， 計算日內(nèi)誤差；另取上述不同濃度的標準血漿各 5份 ， 同法處理 、 進樣 ， 計算日間誤差 。 ? (2)回收率與精密度實驗 ? ① 提取回收率：取上述標準血漿 ， 按標準曲線項下方法處理 ， 進樣 ， 測得峰高 。 ? ② 流動相： ， 以磷酸調(diào) pH值至 ， 過濾 ， 與等量乙腈混合 ， 超聲脫氣 10min。 ? 1． 實驗方法 ? (1)色譜條件 檢測波長： 254nm；色譜柱：Waters NovaPak C18柱 (5um， 150 mm)；流動相：磷酸鹽緩沖液 (， pH值 )乙腈 (1:1)；流速： ；靈敏度： ；柱溫：室溫；進樣量： 10～20 uL。 ? (10)血藥濃度的測定 為了檢驗上述方法是否能滿足 ICA的藥代動力學研究 ， 應用本方法進行了大鼠靜脈注射淫羊藿提取液 。 ? (8)提取溶媒的選擇 本文考察了用乙醇 、 乙酸乙酯及乙醇 :乙酸乙酯 (1:5)為溶媒對 ICA進行提取測定 ， 發(fā)現(xiàn)前者提取回收率小于 60％ ， 而后者雖然提取回收率大于 95％ ， 但帶入雜質(zhì)峰較多 ， 而且色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性下降 。 經(jīng)過調(diào)整不同比例 ， 多次試驗 ， 最后確定四氫呋喃 :水 :冰醋酸最佳配比為 20:75:5。 ? (5)靈敏度測定 按色譜峰信噪比 (S/N)為 3作為檢測下限 ， 結(jié)果顯示 ICA的最低檢測濃度為。 標準品經(jīng)提取后 ， 與標準品直接進樣測定所得各對應標準品與內(nèi)標峰高比值相比較 ， 求得血漿樣品的提取回收率 ， 見表41。 ? 由于糞和尿中的代謝產(chǎn)物干擾內(nèi)標色譜峰 ， 因此糞和尿采用外標法 、 以 ICA峰高為縱坐標 ，ICA濃度為橫坐標繪制標準曲線 。 2． 結(jié)果與討論 ? (1)色譜行為 在上述色譜條件下 ， 淫羊藿苷(icariin， ICA)與內(nèi)標 、 淫羊藿提取液中的其他 6種成分及血漿內(nèi)源性物質(zhì)得到良好分離 (見圖 41)， ICA及內(nèi)標苯甲酸的保留時間分別為 。 (2)生物樣品的處理 ? ① 血漿：取樣品 10 mL離心管中 ， 加入乙酸乙酯 ， 振蕩 3min， 離心 (2022 r/min， 5min)， 移取上清液 ， 于 50℃ 水浴用氮氣吹干 ， 殘渣加內(nèi)標液 100uL， 振蕩溶解后進樣 20uL。 然后再把樣品放回冷凍狀態(tài)保持 12～ 24h， 如此解凍 冷凍應重復循環(huán)二次以上 ， 然后比較各次分析結(jié)果 。 要求高 、 低濃度至少分別測定 3次 ， 與第一天測得的相應濃度的結(jié)果進行比較 。在特定的容器和生物樣品中待測物的穩(wěn)定性不能外推至其他系統(tǒng) 。 空白和零標準不用作標準曲線的計算 ， 僅作為對干擾的考察 。 (五 )線性范圍 ? 線性范圍 (1inear range)是指利用該法取得精密度 、 準確度均符合要求的試驗結(jié)果 ， 而且成線性的供試物濃度的變化范圍 。 所得結(jié)果與接近于定量限的被測物濃度的純?nèi)軇┤芤核媒Y(jié)果進行比較 。 （ 四 ） 方法的專屬性 ? 方法的專屬性 (specificity) 也稱選擇性(selectivity)， 是指樣品中含有其他共存物質(zhì)時 ， 該法定量測定被測物的能力 。 ? 體內(nèi)樣品的濃度檢測限＝儀器的濃度檢測限 樣品稀釋度 ? 例如 ， 取血樣 1mL， 經(jīng)處理后進樣前的血樣最終體積為 ， 已知最低檢測濃度為 106，則血樣中被測物的最低濃度為 106。 也可以 S/N＝ 10或空白背景響應的標準差乘以 10作為估計值 ， 再通過試驗確定 。 按上式計算： ? 即以 S/N＝ 3時 ， 測得樣品的 LOD為 4ng。 （ 三 ） 靈敏度 ? 靈敏度 (sensitivity)是指一種方法可以檢測出有關(guān)化合物的最小量 ， 常用以下幾種表示方法 。 ? 日間 (或批間 )精密度是考察分析方法在不同時間測定結(jié)果的變異情況 。 ? 精密度可進一步分為日內(nèi)或批內(nèi)精密度和日間或批間精密度 。 有多種表示方法 ， 在體內(nèi)藥物分析中常用的表示方法有： 100%SR S DX??相 對 標 準 差 : 21()1niiXXSn?????標 準 差 : ? 精密度測定通常采用高 、 中 、 低三種濃度進行測定 。 ? 因此在報道一個方法的回收率時 ， 必須說明添加量 。 最后與加入量比較 ， 得方法回收率 。內(nèi) 。 對于回收率的大小與變異不宜苛求 ， 一般添加量在 106～109級 ， 絕對回收率若能達到 50％ ～ 80％ ， 應認為是令人滿意的 。 1． 絕對回收率 ? 絕對回收率也稱萃取回收率 、 提取回收率 ， 它反映了一個方法的萃取效率 ， 與體內(nèi)樣品檢測靈敏度有關(guān) ， 是評價體內(nèi)藥物分析方法的重要指標之一 。 ? 將已知量的藥物純品加到空白樣品 (如血樣 )中去 ， 經(jīng)過一系列的處理 、 測定 ， 所得藥物量與加入量之比值的百分率即為回收率 。 方法的評價 ? 對于所建立的體內(nèi)藥物分析方法的可行性與可靠性，需要應用若干標準來進行方法學的考察與評價。 (五 )體內(nèi)實際樣品測定 ? 經(jīng)過上述 (一 )至 (四 )步驟后進行實際樣品的測定 。 能否取得良好的樣品空白實驗結(jié)果 ， 是決定測定方法實際可行性的重要環(huán)節(jié) ， 必須設法解決 。 通常包括下列步驟： （ 一 ） 以純品進行測定 ? 取藥物或其代謝物純品適量 ， 按擬定方法測定 ， 求得濃度與測定響應值之間的關(guān)系 ， 進行線性范圍 、 最適測定濃度 、 檢測靈敏度 、 測定最適條件 (如 pH值 、 溫度 、 反應時間等 ） 等的選擇 。 而用于臨床藥濃監(jiān)測 ， 則要求方法簡便 、 快速 。 與常規(guī)分析方法不同 ， 體內(nèi)藥物分析的對象是來自生物體內(nèi)的樣品 ， 因此對藥物在體內(nèi)的狀況必須了解 ， 如藥動學參數(shù) 、 體內(nèi)代謝情況等 。 分析方法的設定依據(jù) (一 )做好文獻總結(jié) 、 整理工作 ? 對已有報道的藥物進行測定 ， 應系統(tǒng)總結(jié)前人的文獻 ， 從中找出哪些問題已解決 ， 還存在哪些問題等 。 ? 根據(jù) HPCE法的分離模式的不同 。 HPCE是以高電壓電場為驅(qū)動力 ， 以毛細管為分離通道 ， 依據(jù)樣品各組分之間淌度和分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)分離