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2025-05-04 18:13 本頁面
【正文】 常用的 HRP底物為 3， 3， —二氨基聯(lián)苯胺(呈硝酸纖維素膜棕色 )和 4—氯 —1—萘酚 (呈藍(lán)紫色 )。 ? 將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓(100V)和大電流 (1—2A)，通電 45min轉(zhuǎn)移即可完成。 ? 步驟 : ? :蛋白質(zhì)行 SDSPAGE電泳并從聚丙烯酰胺凝膠上 ? 轉(zhuǎn)移至固相載體上 . ? :保持膜上沒有特殊抗體結(jié)合的場(chǎng)所 ,使場(chǎng)所處于飽 ? 和狀態(tài) ,用以保護(hù)特異性抗體結(jié)合到膜上并與蛋白 ? 質(zhì)反應(yīng) . ? (第一抗體 ):特異性 ? :與一抗特異性結(jié)合并作為指示劑 ? ? 封閉：用一種與待測(cè)物不反應(yīng)的物質(zhì) (如蛋白質(zhì)、 ? tween 20等 )封阻載體印跡區(qū)域以外的剩余 ? 吸附位點(diǎn) ,使探針與印跡反應(yīng) ,且不吸附到 ? 載體上 ,此過程稱為封閉 . ? 封閉目的 :使印跡結(jié)果背景干凈 ,印跡的斑點(diǎn)或譜 ? 帶更為清晰 . ? *第一階段為 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDSPAGE)。 ? (3)“ 拖尾 ” 現(xiàn)象 樣品溶解不佳引起 ? (4)“ 紋理 ” 現(xiàn)象 由于樣品中的不溶顆粒引起的 。 (5) 固定 (6) 染色 考馬斯亮藍(lán)（ coomassie brilliant blue） ① R250 三苯基甲烷，紅藍(lán)色，每個(gè)分子含有兩個(gè) SO3H基團(tuán)，偏酸性，和氨基黑一樣也是結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上 。 蛋白帶遷移距離 R f= ———————— 溴酚藍(lán)遷移距離 ? ? 以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)， ? Rf為橫坐標(biāo)繪圖 Rf值，便可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上 ? 讀出他的分子量 * — . ? b. SDS凝膠電泳法測(cè)定分子量，每次測(cè)定樣品必須同時(shí)做 ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線，而不得利用另一次電泳的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ? （二）緩沖系統(tǒng)的選擇 ? 一般情況下，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的 pH范圍， ? 凡不與 SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但 ? 緩沖液的選擇對(duì)蛋白質(zhì)的分離和電泳的速度是非常 ? 關(guān)鍵的。 ? （ 3）蛋白質(zhì) SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超 過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了 ? 不同分子之間原有的電荷差異 蛋白質(zhì) SDS膠束的特點(diǎn) （ 1）形狀像一個(gè)長橢圓棒 （ 2）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基 SDS膠束基本上是相同的 . （ 3）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比 . ? 膠束在 SDSPAGE系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋 ? 白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度， ? 即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大
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