核酸分子雜交技術(shù)ppt課件-wenkub.com
2025-04-28 01:09 本頁面
【正文】 合成時，帶放射性核素標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的 DNA分子中 隨機引物法所具有的優(yōu)點： 能進行雙鏈 DNA、單鏈 DNA或 RNA探針的標(biāo)記 操作簡單方便，避免因 DNaseI處理濃度掌握不當(dāng)所帶來的一系列問題 標(biāo)記活性高，標(biāo)記活性可達 108cpm/181。根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分： DNA/DNA、 RNA/DNA、RNA/RNA 雜交 ? 保持組織細胞的形態(tài) ? 對核酸無抽提，修飾與降解作用 ? 不改變核酸在組織細胞內(nèi)的定位 ? 不阻礙核酸與探針的雜交過程 ? 對雜交信號無遮蔽作用 ? 理化性質(zhì)穩(wěn)定 雜交過程： （ 1）組織或細胞的固定 理想固定液應(yīng)具備： （ 2）組織細胞雜交前的預(yù)處理 ? 去垢劑（如 Triton x100和 SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白質(zhì) ? 組織細胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體 ? 控制消化時間，避免細胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻 片上脫落 （ 3）探針的選擇與標(biāo)記 ? 以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針 ? 探針的長度一般為 50~300bp ,有時達 ? 放射性核素標(biāo)記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定 檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時間長 ? 非核素標(biāo)記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易 于觀察 （ 4）雜交 ? 雜交液體積?。?10~20μl ? cDNA和 RNA探針雜交溫度約為 50℃ ? 雜交時間 :DNA探針雜交為 2~ ? 雜交前一般將組織切片置 95 ℃ 5~15分鐘使 DNA變性 ? 沖洗溫度一般 不超過 50 ℃ （ 5）雜交結(jié)果檢測 ? 所用探針為核素標(biāo)記 ,放射自顯影檢測 ? 所用探針為非核素標(biāo)記 ,比色或化學(xué)發(fā)光檢測 五、液相雜交 指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子的過程。缺點是 DNA分子結(jié)合不牢固 ②尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈 DNA的能力比硝酸 纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高 ③化學(xué)活化膜：優(yōu)點： DNA與膜共價結(jié)合；對不同 大小的 DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點：結(jié)合能 力較上述兩種膜低 Southern印跡的常用方法 （ 1）毛細管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的 DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈： DNA/DNA、 RNA/DNA、 RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸 /RNA。 變性 復(fù)性 DNADNA 雜交雙鏈分子 一、 DNA變性與復(fù)性 （一） DNA變性 定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條 DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱 DNA變性 變性的方法： （ 1）熱變性：溫度升高到 90~100℃ 時，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。第十章 核酸分子雜交技術(shù) 第一節(jié) 核酸分子雜交的基本
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