【正文】 ? 凋亡精確的生化機(jī)制及其不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控；新的凋亡調(diào)控相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)；相關(guān)疾病如腫瘤中凋亡分子機(jī)制的異常；這些機(jī)制在疾病治療中的意義等等。 ? 而更引人注目的 Bcl2家族蛋白作用的生化機(jī)制中與 Caspases和線粒體之間的密切關(guān)系。 ? 線粒體及 Cytoc在細(xì)胞凋亡中的中心地位雖然在不同信號誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中不一定具有普遍意義，但線粒體作為細(xì)胞內(nèi)死亡信號的感受者和放大者在細(xì)胞凋亡中的重要性是勿庸置疑的。 ? Caspasesare a family of cysteine proteases (半胱氨酸蛋白酶 ) that are key mediators of programmed cell death or apoptosis. 129 ? Caspases在細(xì)胞凋亡中的作用： ? Caspases與 CED3在序列和結(jié)構(gòu)上同源，它們是一類進(jìn)化上保守的半胱氨酸蛋白酶家族。 127 ? 脊椎動物則進(jìn)化了一整套的基因家族： 1. 哺乳動物 Caspases與 CED3同源 ； 2. Apaf1基因 與 CED4同源； 3. 哺乳動物 Bcl2基因家族 與 CED9在結(jié)構(gòu)和功能上相似，但分為促進(jìn)和抑制亞群 。美麗線蟲（ Caenorhabditis Elegans）長久以來一直作為研究細(xì)胞凋亡機(jī)制核心組分的一個良好的模型。 124 ? 盡管仍有許多問題甚至是關(guān)鍵的問題沒有搞清楚 ,但近幾年的研究在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細(xì)胞凋亡的生化反應(yīng)機(jī)制以及細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控等方面都取得了顯著的進(jìn)展。 細(xì)胞凋亡 與腫瘤 ? 細(xì)胞凋亡在腫瘤和其它疾病中具有重要的意義。 ? 甲基化 →→ 激活癌基因。 ? 而科學(xué)家認(rèn)為，大約一半的人類疾病可歸咎于基因，而另外一半則與非遺傳因素有密切聯(lián)系，其中表遺傳因素又占據(jù)非遺傳因素的一定比例。 ? 經(jīng)典的遺傳物質(zhì) 核酸儲存和傳遞遺傳信息（ DNARNA蛋白質(zhì)）。那么，又將產(chǎn)生一系列問題： 如何分離 miRNA分子？ 如何尋找 miRNA分子作用的靶基因？ 如何研究 miRNA與靶 mRNA之間的關(guān)系？ ? 短短幾年內(nèi) miRNA研究的迅速突破，為人們提供了一種全新的認(rèn)識基因和基因表達(dá)調(diào)節(jié)本質(zhì)視角，同時也使人們開始注意 miRNA在疾病發(fā)生過程中所扮演角色。 115 C. 具有癌基因功能的miRNA 過表達(dá)也將導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。 當(dāng)前我們所面臨的挑戰(zhàn)是： 這些 miRNA到底具有何種功能？ 它們是如何識別潛在的靶 mRNA的？ 這些 miRNA間相互調(diào)節(jié)作用的結(jié)果是什么？ 與腫瘤發(fā)生及治療中作用？ 113 ，miRNA 正常轉(zhuǎn)錄，加工 ，結(jié)合到靶mRNA 的互補(bǔ)位點，通過抑制蛋白翻譯或是改變mRNA 的穩(wěn)定性來抑制基因表達(dá)。 110 ? ， miRNA主要作用于靶標(biāo)基因 3′ UTR區(qū)，而 siRNA可作用于 mRNA的任何部位。 siRNA合成都是由雙鏈的 RNA或 RNA前體形成的。 107 miRNA與 siRNA的作用機(jī)制： 108 miRNA與 siRNA之間有許多相同之處： 22nt左右。如線蟲的 lin4 ? 2） 二者完全互補(bǔ) ，即二者完全配對結(jié)合后，類似siRNA與靶 mRNA的結(jié)合，特異性的切割 mRNA。 Dicer將 loop與 stem分開。 2)將 premiRNA加工為成熟 miRNA， 22個核苷酸，該過程發(fā)生在 細(xì)胞質(zhì)中。 ? 然而，最近也有證據(jù)表明，這些 miRNA也有可能影響 mRNA的穩(wěn)定性。 隨后，另一個 RNase III Dicer 將其 剪切產(chǎn)生約為 22 個核苷酸長度的miRNA:miRNA*雙鏈 。 98 What are microRNAs？（ 2） ? miRNA具有高度保守性，即各種 miRNA都能在其他種系中找到同源體； ? miRNA獨有的特征：其 5＇端第一個堿基對 U有強(qiáng)烈的傾向性，而對 G卻有抗性，但第二到第四個堿基缺乏 U，一般來講，除第四個堿基外，其他位置堿基通常都缺乏 C . ? miRNA執(zhí)行一定的生物學(xué)功能： 對與其互補(bǔ)的 mRNA表達(dá)水平具有調(diào)節(jié)作用； 一些偏大的 miRNA可能參與了基因組的重組裝（ 27nt）。 97 What are microRNAs？（ 1） ? microRNA（ miRNA,微 RNA）即為長度為 22nt左右的 5′ 端帶磷酸基團(tuán)、 3′ 端帶羥基的非編碼蛋白的調(diào)控小 RNA家族。 ? 有些小 RNA分子 能直接調(diào)控某些基因的開關(guān)，從而控制細(xì)胞的生長發(fā)育并決定細(xì)胞分化的組織類型。 91 ? RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉(zhuǎn)座子活動，防止自私基因序列過量增殖等作用。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來 RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型的報道日益增多，標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。 形成 DNA陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物。將細(xì)胞懸浮液置于電場中會誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差異會導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時穿孔。 5. siRNA表達(dá)框架 siRNA表達(dá)框架 (siRNA expression cassettes， SECs)是一種由 PCR得到的 siRNA表達(dá)模版，包括一個 RNA pol III啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu) siRNA，一個 RNA pol III終止位點，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前克隆到載體中。 ? 盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個 RISC都包含一個 siRNA和一個不同于 Dicer的 RNA酶 (Ago2) 83 如何進(jìn)行 RNAi試驗 (一 )siRNA的設(shè)計 在設(shè)計 RNAi實驗時，可以先在以下網(wǎng)站進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選： tm tml x?SID=45358710 84 (二 )siRNA的制備 公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成 siRNA。 ? 證據(jù)表明；一個稱為 Dicer的酶，是 RNase III家族中特異識別雙鏈 RNA的一員，它能以一種 ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈 RNA，將 RNA降解為2123bp的雙鏈 RNAs(siRNAs)，每個片段的 3’端都有 2個堿基突出。 71 核酶 Ribozyme 72 核酶 73 RNA干擾 ? 近年來的研究表明 ? 將與 mRNA對應(yīng)的正義 RNA和反義 RNA組成的雙鏈 RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使 mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。 70 研究者們建議利用端粒酶抑制劑進(jìn)行腫瘤治療。 69 上述情況表明，絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中都呈端粒酶陽性，而在正常組織中卻無表達(dá)?！边@樣，癌細(xì)胞就能夠像正常細(xì)胞那樣死亡。 ? 但是這里就存在一個問題：是什么阻止端粒無限制變長？ ? 瑞士 Joachim Lingner教授 給出這個問題的答案：他們鑒定出三個蛋白連接在一起而形成一種蛋白復(fù)合物，然后附著到端粒上。 端粒酶與腫瘤 ? 這種突變本身并不足以導(dǎo)致癌癥產(chǎn)生。 ? 細(xì)胞永生化是癌癥的共同特征。 在 G2期 /M期 端粒酶活性逐漸消失。 60 端粒 DNA 逐漸變短的主要原因： ? 細(xì)胞分裂過程中線形染色體的末端端粒DNA不能完全被 DNA指導(dǎo) DNA多聚酶所復(fù)制； ? 末端的特異性和非特異性降解； ? 細(xì)胞異源端粒之間的不均勻重組。端粒的序列長度代表著一個細(xì)胞的壽命。 伊麗莎白 布萊克本 卡蘿爾 格雷德 杰克 紹斯塔克 58 ? 不同物種的端粒 DNA 序列并不一致，人和其它哺乳動物的端粒 DNA序列由 5ˊ —— 3ˊ 方向的（ TTAGGG） n反復(fù)串聯(lián)組成。對染色體具有保護(hù)作用。 直腸癌有高頻率的 p53的突變。 5q21APC 一個拷貝丟失 — 產(chǎn)生腺瘤樣息肉， APC的丟失或突變其早期事件。 ? KISS基因， 1977年 ， Lee,在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)。 ? MTA1基因與乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。 ? 轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因： 基因表達(dá)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。例如 ： 在家族性遺傳性非息肉型結(jié)腸癌（ HNPCC）形成過程 ? 第一次突變（生殖 C ） MMR Gene突變 ，個體對結(jié)腸癌易 患 傾向 ? 第二次突變（體 C）另一等位基因突變 純合子 功能喪失 原癌基因、抑癌基因突變快速積累 細(xì)胞增殖失調(diào) ? 74例 HNPCC家系中研究表明，復(fù)制差（ RER） 陽性率高達(dá) 92%,說明 MMR Gene 發(fā)生突變。 人體細(xì)胞中 DNA 錯配修復(fù)反應(yīng)過程依賴于幾種人類 MMR基因產(chǎn)物 . ? 因此，其中任何一種基因發(fā)生突變導(dǎo)致其產(chǎn)物的功能喪失，將造成 DNA錯配，修復(fù)功能的異常、缺陷、或喪失。 41 人類 MMR系統(tǒng)： ? 現(xiàn)已闡明，人類 MMR基因編碼的錯配修復(fù)蛋白可相互作用，形成一種多聚復(fù)合物，參與細(xì)胞錯配修復(fù)反應(yīng)。 Mut H ? 該系統(tǒng)的修復(fù)機(jī)制主要依賴于 Mut S 、 MutL、 MutH， 基因所編碼的蛋白、酶分子來完成。 故現(xiàn)在又稱為 DNA錯配修復(fù)基因。 ? 研究表明，腫瘤表現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定性： 數(shù)目異常 核型異常 結(jié)構(gòu)異常 都和增變基因突變相關(guān)。癌的發(fā)生就是這一控制功能的喪失。 A、停止細(xì)胞復(fù)制損傷的 DNA。 28 ? B、磷酸化是由一套 Cyclin、 CDK激酶、 CKI控制，即控制細(xì)胞周期中重要的檢 控點（ checkpoint）。 ? ⑥與發(fā)育和干細(xì)胞增殖相關(guān)的信號途徑組分，如 :APC、 Axin等 24 RB Gene產(chǎn)物的功能 RB Gen