【正文】 第五節(jié)蛋白質(zhì)的測序（選讀） 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 156 ? 測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的要求 ? 1）氨基酸組成分析 ? （ 1）樣品必需純（ 97%以上）； ? （ 2）知道蛋白質(zhì)的分子量； ? （ 3）知道蛋白質(zhì)由幾個多肽鏈組成； ? （ 4）測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)。 ? 其他方法 ? 如考馬斯亮藍法 (Bradford法 ) ，靈敏度最高能檢測 1181。 ? 靈敏度低，干擾少，費時太長，現(xiàn)不多用。 ? 在蛋白質(zhì)水溶液中，加入少量的中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等，會增加蛋白質(zhì)分子表面的電荷，增強蛋白質(zhì)分子與水分子的作用，從而使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度增大。 ? 普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細管電泳 ? 從電泳結(jié)果分：自由界面電泳、區(qū)帶電泳、盤狀電泳 ? 從裝置上分：圓盤電泳 （ 柱狀 ） 、 水平板電泳 、 垂直板電泳 。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 141 ? 離心法 ? 借助于離心力，由于比重不同的物質(zhì)所受到的離心力不同，從而沉降速度不同。 ? 交聯(lián)葡聚糖（ Sephadex）、 ? 聚丙烯酰胺凝膠（ BioGel P ）、 ? 瓊脂糖凝膠（ Sepharose， BioGel A） 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 136 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 137 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 138 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 139 半透膜 阻留pr分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以達到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 134 二、混合蛋白質(zhì)分離純化的方法 ? （一）根據(jù)分子大小分離 ? （二）根據(jù)電荷差異分離 ? （三）根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度分離 ? （ 四 ） 根據(jù)配體特性異性分離 （ 親和層析 ） ? 選擇性吸附分離 （ 物理吸附 ） ? 根據(jù)疏水性的差異 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 135 （一）根據(jù)分子大小和形狀的差異 ? 凝膠過濾法 ? 凝膠過濾層析 利用一定大小孔隙的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠作層析介質(zhì)（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等），根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小、形狀不同擴散到凝膠孔隙內(nèi)的速度不同，因而通過層析柱的快慢不同而分離的一種層析法。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。 （ 3）粗分級 ? 一般用選擇性沉淀法。 ? 注意： CO的毒性作用！空氣中 %導致窒息死亡！ ? CO與血紅蛋白的結(jié)合力是氧的 250倍。 ? 而在組織內(nèi)釋放氧的過程也是這樣，一個氧分子的離去會刺激另一個的離去，直到完全釋放所有的氧分子，這種現(xiàn)象稱為 協(xié)同效應 。 α 和 β 都類似于肌紅蛋白，只是肽鏈稍短：α 亞基為 141aa； β 亞基為 146aa。 由 8段 α螺旋構(gòu)成一個球狀結(jié)構(gòu)，拐彎處為18個殘基組成的松散肽鏈， Pro等常存在于拐彎處。由 一條多肽鏈 （ 153個氨基酸殘基）和 一個 亞鐵血紅素輔基組成。 這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 114 （ 5） 乙醛酸反應： ? 色氨酸 Trp及含 Trp的蛋白質(zhì) ? 在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩液層之間就會出現(xiàn)紫色環(huán)，凡含有吲哚基的化合物都有這一反應。濃硝酸滴到皮膚上，過一段時間皮膚就會發(fā)黃，數(shù)天后死皮褪去，就是因為這個原因。一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽部有雙納脲反應，但有雙縮脲反應的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 108 牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu) 二硫鍵 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 109 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 β巰基乙醇 去除尿素、 β巰基乙醇 非折疊狀態(tài)，無活性 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 110 （八） 蛋白質(zhì)的顏色反應 ? （ 1）雙縮脲反應 尿素加熱至 180℃ 左右生成雙縮脲并放出一分子氨。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 107 ? （ 4） 可逆變性與不可逆變性 ? 變性并非都是不可逆的變化，當變性程度較輕時，如去除變性因素，有的蛋白質(zhì)仍能恢復或部分恢復其原來的構(gòu)象及功能，變性的可逆變化稱為 復性 。 ? ③ 溶解度降低 、 沉淀 ， 粘度增加 。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 104 （ 七 ） 蛋白質(zhì)的變性 ? （ 1） 天然蛋白質(zhì)的嚴密結(jié)構(gòu) 在某些物理或化學因素作用下 ， 其特定的空間結(jié)構(gòu)被破壞 ，從而導致理化性質(zhì)改變和生物學活性的喪失 ，如酶失去催化活力 ， 激素喪失活性稱之為蛋白質(zhì)的變性作用 。 ② 有機溶劑沉淀法 ：破壞水化膜 ， 降低介電常數(shù) ，PEG、 丙酮 、 乙醇等 ③ 重金屬鹽沉淀 ： pH＞ pI時帶負電荷 ， 與重金屬離子 （ Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等 ） 結(jié)成不溶性沉淀 ④ 生物堿試劑和某些酸類沉淀法 ： pH小于等電時 ，蛋白質(zhì)帶正電荷 ， 易與生物堿試劑和酸類的負離子生成不溶性沉淀 。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 99 ? 等電點： ? 中性鹽 （ Ca2+ 、Mg2+ 、 Cl 、HPO42+） 影響滴定曲線形狀和等電點 。 ? 通常蛋白質(zhì)溶液是右旋的，但變性后 螺旋結(jié)構(gòu)松開，其左旋性增大。另一種是由結(jié)構(gòu)不同的亞基組成的非均 — 寡聚蛋白，如血紅蛋白（ α 2β 2）。其中，兩個或四個亞基者最多。 所謂蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)就是指寡聚蛋白質(zhì)分子中亞基與亞基間的立體排布及相互作用關(guān)系，亞基的數(shù)目和類型也屬四級結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)容，但不涉及亞基本身的構(gòu)象。 ? （二）亞基與蛋白質(zhì)生物活性的關(guān)系 ? 亞基單獨存在時無生物活性，只有相互聚合成特定構(gòu)象時才有完整的生物活性。但不涉及亞基內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 （ 4）三級結(jié)構(gòu)形成之后，蛋白質(zhì)分子的生物活性部位就形成了。 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象特點 （ 1）三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象近似球形。結(jié)構(gòu)域進一步締合則形成近似球形的三級結(jié)構(gòu)。 ? 也指多肽鏈中所有原子和基團的構(gòu)象，也包括所有主鏈和側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 83 二級結(jié)構(gòu)的多元性 球狀蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)一般都不是單一構(gòu)象。是近年來在球狀蛋白質(zhì)分子中發(fā)現(xiàn)的一種主鏈構(gòu)象。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 80 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 81 蛋白質(zhì) β— 折疊 結(jié)構(gòu) （二） β 折迭又叫 β 折迭片或 β 片層結(jié)構(gòu)，也是蛋白質(zhì)分子中常見的主鏈構(gòu)象之一。若一段肽鏈有多個 Glu或 Asp相鄰 ,則因 pH= ,防礙 α 螺旋的形成 。氫鍵取向與主軸基本平行。 四、 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 78 （ 一 ） α螺旋結(jié)構(gòu) 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 79 蛋白質(zhì) α 螺旋結(jié)構(gòu) ?右手螺旋 (順時針 )。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 76 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 77 ?二級結(jié)構(gòu)：是多肽主鏈本身在空間的排列 ,或規(guī)則的幾何走向 、 折疊和盤繞的方式 。 ? 是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu) ， 它是由基因 （ 遺傳信息 、遺傳密碼 ） 決定的 。 ? 蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線，通常是 將分子量在 6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 70 ? （ 4）腦肽 ? 有鎮(zhèn)痛作用而又不會像嗎啡，使病人成癮的藥物，中科院上海生化所 1982年利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)成功地合成 Leu— 腦啡肽。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 69 ? （ 3）抗菌肽 是生物體內(nèi)經(jīng)誘導產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽。 ? 雙縮脲反應是肽和蛋白質(zhì)特有的反應 ， 游離氨基酸無此反應 。 ? 在長肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團主要是側(cè)鏈基團。 ? 結(jié)構(gòu)簡寫 ,N末端寫在左邊， C末端寫在右邊（即從 N→ C）。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 62 多肽鏈可以看成由 aa串聯(lián)起來的無數(shù)個酰胺平面組成 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 63 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 64 ? 肽的命名及結(jié)構(gòu) ? 一個肽可根據(jù)其所含的氨基酸殘基數(shù)簡單地稱為 二肽、三肽、四肽 等。 ? 肽鍵： 氨基酸間脫水后形成的共價鍵稱肽鍵 （ 酰氨鍵 ） 。 ? 這種分離主要與各種離子所帶電荷有關(guān)，在電荷相同時，與極性，非極性有關(guān)。 ? （ 3）物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置可用 Rf（比移值） 來表示，在一定的條件下某種物質(zhì)的 Rf值是常數(shù)。 常見的層析法有： 紙層析、薄層層析、離子交換層析、氣相層析、高效液相層析、親和層析 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 49 （一）紙層析 ? 用濾紙作為支持物進行層析的方法，是分配層析的一種。Edman（瑞典 ）用來鑒定多肽的 NH2末端氨基酸 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 43 與 ?；噭┓磻? 芐氧甲酰氯（苯甲氧甲酰氯）（ carbobenzyloxychloride,Cbzcl) 叔丁氧甲酰氯 對 甲苯磺酰氯 鄰苯二甲酸酐 丹磺酰氯 多肽的人工合成中被用作氨基保護劑。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 39 氨基酸的與醛類反應 ? 生成西佛堿 （ Schiff） ， 西佛堿是某些酶促反應的中間產(chǎn)物 （ 如轉(zhuǎn)氨基反應的中間產(chǎn)物 ） 。 ? ? pH = pI時 ， 氨基酸凈電荷為零 ? pH pI時 ， 氨基酸帶正電荷 ， NH2解離成 NH3+， 向負極移動 。 ? 摩爾吸收系數(shù)、波長 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 32 （ 二 ） 氨基酸的化學性質(zhì) ? 氨基酸兩性解離和等電點 ? （ 1） 氨基酸在晶體和水溶液中主要以兼性離子形式存在 ? ① 晶體熔點高 ， 離子晶格 ， 不是分子晶格； ? ② 除胱 、 酪外 ， AA易溶于水 ， 水溶液中的氨基酸是極性分子； ? ③ 除脯 、 羥脯外 ， 不溶于非極性溶劑 ， 可用乙醇使氨基酸沉淀析出 。 ? 構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均屬 L型。 ? 胱氨酸和酪氨酸（ Tyr）在體內(nèi)可分別由蛋氨酸和苯丙氨酸轉(zhuǎn)變而來，稱 半必需氨基酸 。 （ 5） Tyr的衍生物： 二碘酪氨酸 、 甲狀腺素 （ 甲狀腺蛋白中 ） 。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 26 ? 在蛋白質(zhì)中 ? 非極性 aa一般形成蛋白質(zhì)的疏水核心； ? 不帶電何的極性氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵 ， 易溶于水 ， 帶電荷的 aa和極性 aa位于表面 。 組氨酸（ Hi