【正文】 （四）采用非生物素缺陷型突變株 選育不需要生物素的谷氨酸產(chǎn)生菌，即非生物素缺陷型突變株，從遺傳上解除生物素對谷氨酸積累的控制。 采用谷氨酸溫度敏感突變株進行發(fā)酵，其發(fā)酵控制方式與現(xiàn)行的采用生物素亞適量的控制方式完全不同。 加入青霉素后，進而在菌體再度倍增期間，使新增殖的細胞沒有充足的細胞壁合成，菌體形態(tài)急劇變化，多呈現(xiàn)伸長、膨潤的菌型，完成谷氨酸非積累型細胞向谷氨酸積累型細胞轉(zhuǎn)變，此轉(zhuǎn)移期間是非常重要的。 影響產(chǎn)酸的關(guān)鍵 在生長的什么階段添加青霉素是影響產(chǎn)量的關(guān)鍵。 在發(fā)酵對數(shù)生長期早期，添加青霉素能抑制菌體細胞壁的合成，形成不完全的細胞壁，進而導致形成不完全的細胞膜，除去阻礙谷氨酸向外滲透的障礙物，使谷氨酸得以大量的積累。通過拮抗脂肪酸的生物合成，達到控制磷脂合成，導致磷脂合成不足，結(jié)果形成磷脂合成不足的不完全的細胞膜，提高了谷氨酸向膜外漏出的滲透性。國外，谷氨酸發(fā)酵主要是以糖蜜為發(fā)酵原料，采用大種量 (10%左右 )、添加青霉素低糖流加發(fā)酵工藝。 流加（補糖）發(fā)酵工藝，中后期殘?zhí)菨舛葢?yīng)根據(jù)不同菌種經(jīng)過多次試驗確定，一般在 ～ 5%之間。 在谷氨酸發(fā)酵中某一生長階段，生長菌攝氧率與底物消耗速率之間存在著線性關(guān)聯(lián)。即使是全部為糖質(zhì)原料也可選用不同種原料混合使用，既可用部分廉價原料又能提高產(chǎn)酸。 ② 降低發(fā)酵初糖濃度，連續(xù)流加糖發(fā)酵 降低發(fā)酵的初糖濃度，可降低滲透壓，有利于菌體生長和代謝產(chǎn)物的分泌，同時提高氧的傳遞速率，提高溶氧水平，特別是對采用高生物素、大種量、添加青霉素的強制發(fā)酵工藝更為重要。但是，糖濃度高，滲透壓大，菌體不適應(yīng)。 許多生化標記突變株的谷氨酸發(fā)酵對糖轉(zhuǎn)化率比親株有大幅度提高，有些超過60%。 谷氨酸發(fā)酵是一復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，影響因素很多，提高谷氨酸發(fā)酵的生產(chǎn)水平必須從以下幾方面進行： ①選育優(yōu)良的高產(chǎn)菌種； ②適宜的環(huán)境條件； ③好的原料質(zhì)量； ④合理的發(fā)酵設(shè)備； ⑤有效的管理措施。許多重要的研究成果已經(jīng)利用于谷氨酸的生產(chǎn)，使谷氨酸的產(chǎn)量、對糖轉(zhuǎn)化率均有很大提高，發(fā)酵周期也不斷縮短。處理方法①及時流加液氨，提高 pH；②按染菌處理。如染菌則按染菌處理。 ⑶ 中后期耗糖慢、產(chǎn)酸低，原因是菌種老化、前期通風過大、種子或發(fā)酵溫度前期過高、生物素不足。由于谷氨酸發(fā)酵是一系列的生化反應(yīng)過程，影響因素很多，所產(chǎn)生的異?，F(xiàn)象也是多種多樣的。因產(chǎn)酸快， pH下降亦快，應(yīng)加大通氨速率，使 pH維持在 。轉(zhuǎn)化期控制的好壞是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵。 轉(zhuǎn)化期為代謝最旺盛階段，耗糖加快，谷氨酸積累迅速增加，耗氧速率加快，并接近最大值。耗氧量很快增加，發(fā)酵液的溶氧下降，應(yīng)根據(jù)情況提高風量，特別是對數(shù)生長期末期應(yīng)注意風量。 ② 對數(shù)生長期 菌體經(jīng)過適應(yīng)期后就開始繁殖，并很快進入對數(shù)生長期，代謝逐漸旺盛，菌體大量繁殖， OD直線上升，菌體形態(tài)與二級種子相同，絕大多數(shù)為八字形排列。根據(jù)菌體在發(fā)酵過程中變化和作用，可把發(fā)酵過程分為四個階段來敘述。在配料時加入少量消泡劑，對發(fā)酵前期控制泡沫有較好作用，然后根據(jù)需要流加，有利于發(fā)揮消泡劑的作用。 BAPE和 PPE屬非離子型表面活性劑，消泡能力強、用量少、毒性低和使用方便。 發(fā)酵工業(yè)上常用的消泡劑主要有四類： ①天然油脂類； ②高碳醇、脂肪酸和脂類； ③聚醚類； ④硅酮類。當消泡劑加入發(fā)泡體系中，由于消泡劑的表面張力低 (相對于發(fā)泡體系 )，在消泡劑接觸液膜面時，成為泡膜的一部分，使泡膜面擴大，使泡膜變薄，同時使泡膜局部表面張力降低，氣泡破裂、合并，最后導致泡沫破滅。 機械消泡的優(yōu)點是不需要在發(fā)酵液中加入其它物質(zhì)，節(jié)省消泡劑，減少加入消泡劑所引起的污染機會；其缺點是不能從根本上消除引起泡沫穩(wěn)定的因素，消泡效果不如化學消泡劑迅速可靠。通氣和攪拌強度大，泡沫增加。葡萄糖等本身起泡能力很差，但豐富培養(yǎng)基中濃度較高的糖類增加了培養(yǎng)基的粘度，使泡沫穩(wěn)定。如果液體表面黏度足夠大，氣泡間液體流失減少，液膜便能克服外力的振動，使泡沫穩(wěn)定。一般起泡劑分子的烴鏈越長，鏈間的分子引力 (范德華引力 )越大，膜的機械強度越大。 表面張力是一種沿著液體表面并與表面平衡的，力圖使表面縮小的力，各種物質(zhì)由于它們分子問的相互作用力不同，表面張力就不同。谷氨酸正常發(fā)酵所形成的就是這一類。 在發(fā)酵工業(yè)中所形成的泡沫，其分散相是空氣和CO2，連續(xù)相是發(fā)酵液。 泡沫過多產(chǎn)生如下問題：①引起大量逃液而造成浪費和污染；②泡沫上升到罐頂可能從軸封滲漏而造成雜菌污染；③減少發(fā)酵罐的裝填系數(shù)，降低設(shè)備利用率；④影響氧的傳遞和通氣攪拌效果；⑤當泡沫穩(wěn)定時，代謝氣體不能及時排出，影響菌體的正常呼吸作用，甚至造成菌體自溶?？刂婆艢庵?CO2簡便易行，一方面可以保證供氧，另一方面還能幫助發(fā)現(xiàn)污染雜菌或噬菌體。可以采用間斷或連續(xù)測定排氣中 CO2濃度的辦法來調(diào)節(jié)通氣量，以滿足供氧要求。谷氨酸生物合成需要 CO2固定反應(yīng)，由磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成草酰乙酸，提供合成谷氨酸所必需的四碳二羧酸。在菌呼吸充足條件下，產(chǎn)酸最高；而在氧不足的情況下，產(chǎn)酸略有降低。但是，亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸發(fā)酵卻是在供氧較低的條件下，產(chǎn)酸最高。在供氧充足的條件下，細菌呼吸充足，溶氧分壓(PL)大于或等于臨界溶氧分壓(PL臨界 )的培養(yǎng)中，可以得到最大產(chǎn)酸量。 → 谷氨酸 +8NAD(P)H2+FADH2+3ATP 圖 42 谷氨酸生物合成途徑（ I） 從圖 42的谷氨酸生物合成途徑可知，由 3/2mol葡萄糖生成 3mol乙酰 CoA，其中 2mol乙酰 CoA與草酰乙酸反應(yīng)生成 2mol異檸檬酸，1mol異檸檬酸經(jīng)過 α酮戊二酸生成谷氨酸，另 1mol異檸檬酸分解為琥珀酸和乙醛酸，兩者都生成草酰乙酸；剩余的 1mol乙酰 CoA與乙醛酸生成草酰乙酸時被利用。 谷氨酸發(fā)酵的物質(zhì)能量代謝 氨基酸發(fā)酵中，需氧是菌體代謝的需要，有以下兩個原因： ①經(jīng)過好氣性的能量代謝可以有效地獲得菌體生長和氨基酸生物合成所需的 ATP，以完成生物氧化作用； ②氨基酸生物合成過程中產(chǎn)生的 NAD(P)H2需要在氧存在下被氧化成 NAD(P)。耗氧速率與菌體生長速率、耗糖速率和谷氨酸生成速率有關(guān)。一般培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，糖濃度高，生物素含量高，則需氧量大。因此，在谷氨酸生成期要求充分供氧，以滿足細胞最大呼吸的需氧量。如果再提高供氧，不但不能促進生長，反而造成浪費，而且由于高溶氧水平而抑制菌體生長。 在菌體生長期，供氧必須滿足菌體呼吸的需氧量，即 rab=QO2 表 45 氨基酸發(fā)酵 pL臨界 和 γab/(QO2 溶解氧與谷氨酸產(chǎn)生菌的需氧量 谷氨酸產(chǎn)生菌和其它好氣性微生物一樣，對培養(yǎng)液中的溶解氧濃度有一個最低的要求，在此溶解氧濃度以下，微生物的呼吸速率隨溶解氧濃度降低而顯著下降。因此研究供氧問題，對氨基酸發(fā)酵工藝管理的最佳化和工藝過程的放大具有重要意義。其優(yōu)點是由于尿素的分解、利用及 pH變化具有一定的規(guī)律性，容易控制。由于作用快，應(yīng)采用連續(xù)流加的方法，最好能自動控制連續(xù)流加。 菌種不同，所含酶系及其活力不同，培養(yǎng)基中糖、氮的種類和配比不同以及通風、攪拌強度不同，調(diào)節(jié) pH方法不同等，pH的變化規(guī)律性就不相同。 發(fā)酵過程中 pH變化及控制 在谷氨酸發(fā)酵過程中，由于菌體對培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的利用和代謝產(chǎn)物的積累，使培養(yǎng)基的 pH不斷變化。各種菌種又有所不同，黃色短桿菌 672 ～ ；北京棒桿菌 ～； T613 ～ 。 pH對谷氨酸發(fā)酵的影響 pH對微生物生長和代謝產(chǎn)物的形成都有很大影響。在發(fā)酵中后期菌體生長已停止，為了大量積累谷氨酸，需要適當提高溫度，有利于提高谷氨酸產(chǎn)量。微生物種類不同，所具有的酶系不同，所要求的溫度也不同。但是，酶是蛋白質(zhì)，受熱容易失活，溫度愈高失活愈快。 Q發(fā) =GC(t2t1)/V ② 通過發(fā)酵溫度自動控制，先使罐溫達到恒定，再關(guān)閉自動控制裝置，測量溫度隨時間上升的速率，按下式求出發(fā)酵熱。h) ③ 汽化熱 通風時，會引起發(fā)酵液部分水分蒸發(fā)，發(fā)酵液因蒸發(fā)而被帶走的熱量稱為汽化熱。特別是從對數(shù)生長轉(zhuǎn)入平衡期時，菌體濃度最大，代謝旺盛，產(chǎn)生的熱量最多。發(fā)酵過程產(chǎn)生的熱量具有強烈的時間性。 ① 生物熱 在發(fā)酵過程中，由于菌體的生長繁殖和形成代謝產(chǎn)物，不斷地利用營養(yǎng)物質(zhì)，將其分解氧化獲得能量，其中一部分能量用于合成高能化合物（如 ATP），供合成細胞物質(zhì)和合成代謝產(chǎn)物所需要的能量。甘蔗糖蜜中生物素含量也會與產(chǎn)地、處理方法、貯存期長短等有關(guān)，故每批原料變動時均需小試以確定用量。 麩皮水解液可代替玉米漿，但蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)成分比玉米漿少，用量一般為 1%（以干麩皮計）左右。 提供生長因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料 玉米漿是一種用亞硫酸浸泡玉米而得的浸泡水的濃縮物。 維生素 B1是由嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)結(jié)合而成的一種 B族維生素，又稱硫胺素或抗神經(jīng)炎素。當供氧不足，生物素過量，發(fā)酵向乳酸發(fā)酵轉(zhuǎn)換。谷氨酸發(fā)酵最適生物素濃度隨菌種不同、碳源種類和碳源濃度以及供氧條件不同而不同，一般為 5μg/L左右。 生物素是 B族維生素的一種，又稱維生素 H或輔酶 R，其結(jié)構(gòu)式如下： 生物素作為酶的組成成分，參與機體的三大營養(yǎng)物質(zhì) —— 糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝，是動物機體不可缺乏的重要營養(yǎng)物質(zhì)之一。 ⑤ 生長因子 從廣義來說，凡是微生物生長不可缺少的微量有機物質(zhì)，如氨基酸、堿基（嘌呤、嘧啶）、維生素等均稱