【正文】 23 各類高效液相色譜法簡(jiǎn)介 1．分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附 活性中心能力的差異 分離前提： K不等或 k不等 )1(0mR VSKtt ???mVSKk ??一、液固吸附色譜法（ LSC） 流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑 2．固定相：與 LC比，固定相粒徑不同（ 10μm） （ 2） 高分子多孔小球： YSG 原理：吸附 +分配 蒹小孔凝膠作用 特點(diǎn)：柱選擇性好 ， 峰形好 ， 柱效低 適用：分離弱極性化合物 （ 1）硅膠 表孔硅膠（薄殼硅膠） 全多孔硅膠 無定形 YWG 5~6μm 5 104 球形 YQG 3~4μm 8 108 堆積硅珠 YQG 3~4 μm 8 108 理想 原理：吸附 特點(diǎn)：峰易拖尾 適用：分離極性化合物 3． 流動(dòng)相：底劑 （ 烷烴 ） + 有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑 ? 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿 4． 影響 k的因素：與固定相性質(zhì)和流動(dòng)相性質(zhì)有關(guān) 溶質(zhì)分子極性 ↑ ， 洗脫能力 ↓ ， k↑ ， tR↑ 溶劑系統(tǒng)極性 ↑ ， 洗脫能力 ↑ ， k↓ ， tR↓ ? 注：調(diào)節(jié)溶劑極性 ， 可以控制組分的保留時(shí)間 5． 出柱順序：強(qiáng)極性組分后出柱 ， 弱極性組分先出柱 6． 硅膠吸水量 ↑ ， LSC→ LLC ? 硅膠含水量較小 吸附色譜 硅膠極性較大 ? 硅膠含水量 17% 分配色譜 硅膠失活 → 載體 吸附的水 → 固定液 1． 分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異 2． 固定相：載體 +固定液 （ 物理或機(jī)械涂漬法 ） ? 缺點(diǎn)：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大 ， 易流失 ， 不實(shí)用 固定液 —— 極性 → NLLC 固定液 —— 非極性 → RLLC 3． 正相色譜 ——固定液極性 流動(dòng)相極性 （ NLLC） ? 極性小的組分先出柱 ， 極性大的組分后出柱 ? 適于分離極性組分 反相色譜 ——固定液極性 流動(dòng)相極性 （ RLLC） ? 極性大的組分先出柱 ， 極性小的組分后出柱 ? 適于分離非極性組分 二、液液分配色譜法（ LLC） （一）常規(guī)化學(xué)鍵合相 利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面 1． 分離機(jī)制：分配 + 吸附 （ 以 LLC為基礎(chǔ) ） 2． 特點(diǎn)： 不易流失 熱穩(wěn)定性好 化學(xué)性能好 載樣量大 適于梯度洗脫 化學(xué)鍵合固定相 （二）反相鍵合相固定相 1． 分離機(jī)制：疏溶劑理論 正相 —— 流動(dòng)相與溶質(zhì)排斥力強(qiáng) ， 作用時(shí)間 ↑ ， k↑ ， 組分 tR↑ 反相 —— 流動(dòng)相與溶質(zhì)排斥力弱 ， 作用時(shí)間 ↓ ， k↓ ， 組分 tR↓ 2． 固定相： 極性小的烷基鍵合相 C8柱 ， C18柱 （ ODS柱 —— HPLC約 80%問題 ） 3． 流動(dòng)相： 極性大的甲醇 水或乙腈 水 流動(dòng)相極性 固定相極性 底劑 + 有機(jī)調(diào)節(jié)劑 （ 極性調(diào)節(jié)劑 ） ? 例：水 + 甲醇 ， 乙腈 ， THF 4． 流動(dòng)相極性與 k的關(guān)系： 流動(dòng)相極性 ↑ ， 洗脫能力 ↓ ， k↑ ， 組分 tR↑ 5． 出柱順序：極性大的組分先出柱 極性小的組分后出柱 6． 適用：非極性 ~中等極性組分 （ HPLC80%問題 ） （三）正相鍵合相色譜 1． 分離機(jī)制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力 、 誘導(dǎo)力 、 或氫鍵作用力 2． 固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相 3． 流動(dòng)相：極性小 （ 同 LSC） 底劑 + 有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑 ? 例：正己烷 + 氯仿 甲醇 ， 氯仿 乙醇 4． 流動(dòng)相極性與 k的關(guān)系： 流動(dòng)相極性 ↑ ， 洗脫能力 ↑ ， 組分 tR↓ ， k↓ 5． 出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分 ， 極性小的組分先 出柱極性大的組分后出柱 6． 適用： ? 氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似 （ 極性稍小 ） 分離物質(zhì)也相似 ? 氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大 ， 堿性 分析極性大物質(zhì) 、 糖類等 1．反相離子對(duì)色譜法（ IPC或 PIC） 反相色譜中 ， 在極性流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑 ， 使被測(cè)組分 與其中的反離子形成中性離子對(duì) ， 增加 k和 tR， 以改善分離 1） 離子對(duì)試劑：烷基磺酸鈉 → 分析堿 四丁基季胺鹽 → 分析酸 2） 影響 k的因素 a． 與 m的極性有關(guān) （ 同反相色譜 ） b． 與 R的鏈長(zhǎng)有關(guān)： R↑ 長(zhǎng) ， 極性 ↓ 小 ， tR↑ ， k↑ 3） 適用：較強(qiáng)的有機(jī)酸 、 堿 ? 三、離子色譜法（ IC） 2．反相離子抑制色譜 在反相色譜中 ， 通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動(dòng)相 pH值 ， 抑制 組分解離 ， 增加其 k和 tR， 以達(dá)到改善分離的目的 1） 離子抑制劑：弱酸 、 弱堿性物質(zhì) pH一定的緩沖溶液 2） k的影響因素： 與流動(dòng)相極性有關(guān) ， 還與 pH值有關(guān) ? 選擇流動(dòng)相：應(yīng)同時(shí)考慮極性及 pH值 酸性物質(zhì) —— 加入酸 HAc tR↑ ， k↑ 堿性物質(zhì) —— 加入堿 NH339。239。 （ 蛋白質(zhì) 、 氨 基酸 、 常見陰陽離子等 ） 利用多孔凝膠固定相建立空間排阻色譜法可分 離高分子化合物 。 且流動(dòng)相種類較多 ， 選擇余地廣 ， 改 變流動(dòng)相極性和 pH值也對(duì)分離起到調(diào)控作用 ， 當(dāng) 選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相 也可以增大分離選擇性 。它在經(jīng)典色譜理論的基礎(chǔ)上，采用了高壓泵、化學(xué) 鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢測(cè)器等新實(shí) 驗(yàn)技術(shù)建立的一種液相色譜分析法。 ? 三、儀器特點(diǎn)： ? 分流器和尾吹氣裝置 毛細(xì)管柱 ? ?167。此時(shí)用欲測(cè)組分的純物質(zhì)加稀釋劑 (對(duì)液體樣品用溶劑稀釋、氣體樣品用載氣或空氣稀釋 )配成不同含量 (％ )標(biāo)準(zhǔn)溶液， 取固定量標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析 ，從所得色譜圖上測(cè)出響應(yīng)訊號(hào) (峰面積或峰高等 )、然后繪制響應(yīng)信汛號(hào)(縱坐標(biāo) )對(duì)百分含量 (橫坐標(biāo)）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。)M(iM MMfMmAMmAfff ??? ? 四、定量計(jì)算方法 ? 歸一化法：若樣品中所有的組分均能流出色譜柱且有較好的、可分辨的色譜峰時(shí)可用此法定量。i Amf ?（ Mass calib