20xx年醫(yī)學專題—免疫組化、免疫熒光、流式細胞術(shù)的應(yīng)用比較及常見問題分析-資料下載頁
2025-10-26 23:06本頁面
【正文】 80,第二十六頁，共三十五頁。,熒光補償(bǔch225。ng)示原理,熒光補償是指修正熒光滲漏(sh232。n l242。u)的過程，如從探測器出去除匹配熒光以外的任何熒光信號。 當采用兩種或兩種以上熒光標記時（如FITC,PE），當攜帶兩種熒光素的細胞受到激光照射激發(fā)時，將發(fā)出兩種不同波長的熒光。然而，熒光染料所發(fā)出的熒光都具有一定的波長范圍（寬發(fā)射譜性質(zhì)），雖然各自的熒光峰值不同，但發(fā)射譜范圍會有一定的重疊。因而就會造成不同通道之間的熒光干擾，對實驗結(jié)果造成影響。,第二十七頁，共三十五頁。,熒光(y237。ngguāng)補償示意圖,第二十八頁，共三十五頁。,Annexin VFITC/PI凋亡檢測(jiǎn c232。)原理,在細胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。 Annexin V是一種分子量為3536kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸PS高親和力特異性結(jié)合。 將Annexin V進行熒光素（FITC、PE）或Biotin標記，以標記了的Annexin VFITC作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。 碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過(t242。u ɡu242。)完整的細胞膜，但在細胞凋亡中晚期的細胞和死細胞，碘化丙啶PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將 Annexin V 與PI 匹配使用，就可以將細胞凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。,第二十九頁，共三十五頁。,圖片(tpi224。n)引自,第三十頁，共三十五頁。,Annexin VFITC /PI 凋亡(diāo w225。nɡ)檢測結(jié)果分析,第三十一頁，共三十五頁。,熒光強度/背景(b232。ijǐng)過高 一抗/二抗?jié)舛忍?，建議降低一抗/二抗?jié)舛取?封閉不完全，建議增加蛋白封閉時間。 洗滌不充分，建議增加沖洗次數(shù)與時間。 信號弱或無信號 無目的蛋白或表達量極少，建議選用表達量高的細胞。 細胞通透性差，建議增加通透劑的作用時間或濃度。 一抗/二抗?jié)舛忍?，建議增大其濃度。 二抗選擇錯誤（種屬不匹配），建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。 柱形圖分析時出現(xiàn)熒光雙峰 抗原本身特性所決定（比如不同時期的細胞蛋白表達量不同） 進樣針堵塞，建議清洗管路。 進樣速度太快，建議調(diào)低進樣速度。 管路系統(tǒng)偏移導致焦距偏離，建議請專業(yè)維修人員校準。,流式細胞術(shù)常見問題分析(fēnxī),第三十二頁，共三十五頁。,IHC、IF、FC區(qū)別(qūbi233。)與聯(lián)系,第三十三頁，共三十五頁。,Thank you for your time,第三十四頁，共三十五頁。,內(nèi)容(n232。ir243。ng)總結(jié),免疫組化、免疫熒光、。操作過程中沖洗不充分，建議增加沖洗的次數(shù)(c236。sh249。)與沖洗時間。操作過程沖洗過度，建議適度沖洗。一抗種屬來源來源不同。可與F肌動蛋白結(jié)合，使F肌動蛋白保持穩(wěn)定。封閉不完全，建議增加蛋白封閉時間。用普通的封片劑封片，建議選用防熒光猝滅劑封片。進樣速度太快，建議調(diào)低進樣速度。一般只能檢測一個參數(shù),第三十五頁，共三十五頁
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