【正文】 h factor factor β，TGFβ）抑制性信號(hào)分子Smad 7表達(dá)，調(diào)控TGFβSmad信號(hào)通路，抑制體外培養(yǎng)靜止期HSC活化，阻斷TGFβ1促靜止期HSC活化效應(yīng)，Tet還誘導(dǎo)活化HSC活化逆轉(zhuǎn)。部分最新研究成果已經(jīng)整理成文發(fā)表在本領(lǐng)域有一定影響力的SCI索引源期刊上，并被SCI收錄(收錄號(hào) IDS Number: 963XN)[2]（相關(guān)文章參詳見申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷及附件二、三）。這些全新研究成果進(jìn)一步增強(qiáng)了我們開發(fā)這一傳統(tǒng)中藥的信心。TGFβ1是目前認(rèn)識(shí)的最重要的促肝纖維化因子。抑制TGFβ1對(duì)HSC的作用一直以來均是抗肝纖維化重要著眼點(diǎn)[3]。Smad 7是HSC TGFβ信號(hào)通路的最主要負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號(hào)分子，上調(diào)Smad 7是抑制TGFβ對(duì)HSC不良生物效應(yīng)的有措施之一[4]。在肝纖維化過程中，TGFβ信號(hào)通路還與整合素信號(hào)通路存在密切聯(lián)系。這表現(xiàn)在三個(gè)方面：①XXXXXX。②XXXXXX。③XXXXXXXXX。綜上所述，XXXXXXX，如能XXXXXX，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)XXXXX治療。基于以上研究結(jié)果，我們研究室在國(guó)家自然科學(xué)基金資助下，過去三年中應(yīng)用化學(xué)方法合成了RGD和M6P，并將RGD與M6P結(jié)合成一新型復(fù)合分子RGDM6P，研究比較了它們對(duì)HSC靶向性及在抑制其功能中的作用（項(xiàng)目名稱：RGD修飾細(xì)胞生物信息調(diào)控分子和綴合基因的功能研究，編號(hào)：30170412）。我們的研究發(fā)現(xiàn)，RGD和RGDM6P均可抑制HSC活化。RGD在抑制TGFβ激活同時(shí)，還可阻止HSC與ECM結(jié)合，阻斷整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究還發(fā)現(xiàn)，M6P能提高RGD作用于HSC的靶向性，增加其局部濃度，使RGDM6P顯示出較RGD更強(qiáng)的抑制作用[14]。我們首次證實(shí)，新型復(fù)合分子RGDM6P用于抗肝纖維化治療，無論在對(duì)HSC靶向的特異性，還是多位點(diǎn)聯(lián)合作用方面，都優(yōu)于單一的含RGD序列的肽段或M6P（參見基金結(jié)題摘要，相關(guān)文章參見申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷及附件四）。RGDM6P新型復(fù)合分子的研制成功及其對(duì)HSC靶向與抑制功能的發(fā)現(xiàn)，有助于我們?nèi)パ芯扛嗟腍SC靶向選擇性高、局部作用強(qiáng)、系統(tǒng)毒性小的新型藥物和(或)制劑，從而提高藥物的療效、減輕毒性反應(yīng)。結(jié)合我們對(duì)Tet藥理作用的分子機(jī)制的研究結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)，XXXXXXXX?；谝陨舷盗醒芯炕A(chǔ)與設(shè)想，緊跟國(guó)內(nèi)外在制劑學(xué)方面的進(jìn)展，我們擬設(shè)計(jì)XXXXXXXXXXX。當(dāng)前，受體調(diào)節(jié)藥物靶向（receptormediated drug targeting）作為一種新型的給藥系統(tǒng)受到人們的重視[16]。XXXXXXXXXXXXXXXXX。迄今為止，尚未見到XXXXXXXXXXX。結(jié)合國(guó)內(nèi)外同行的研究報(bào)道與我們的研究基礎(chǔ)，不難推斷，XXXXXXXXXXXXXXXXX。綜上所述，我們擬在XXXXXXXXXX。本研究將為XXXXXXXX等提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。XXXXXXXXXX可以設(shè)想，如能取得預(yù)期效果，經(jīng)過良好設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)研究后，這一XXXXXX應(yīng)用于臨床的時(shí)間不會(huì)太久，前景廣闊。參考文獻(xiàn) Friedman of disease: Mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2004。1(2): Chen YW, Li DG, Wu JX, et inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factorbeta in vitro via upregulation of Smad Ethnopharmacol 2005。100(3): Breitkopf K, Haas S, Wiercinska E, et strategies for the treatment of chronic liver Clin Exp Res 2005。29(11 Suppl): Dooley S, Hamzavi J, Breitkopf K, et prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in 2003。125(1): Ludbrook SB, Barry ST, Delves CJ, et integrin alphavbeta3 is a receptor for the latencyassociated peptides of transforming growth factors beta1 and J 2003。369(Pt 2): Annes JP, Chen Y, Munger JS, et alphaVbeta6mediated activation of latent TGFbeta requires the latent TGFbeta binding Cell Biol 2004。165(5): 、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵問題 ： XXXXX化學(xué)合成與鑒定，二硬脂酸磷酯酰胺XXXXXXXXXX 合成與鑒定。 不同類型脂質(zhì)體的制備、技術(shù)參數(shù)優(yōu)化、物理性質(zhì)鑒定和脂質(zhì)體藥物包封率、載藥量、配體結(jié)合率鑒定與提高。 大鼠HSC分離培養(yǎng)，XXXXXXX 修飾脂質(zhì)體與肝星狀細(xì)胞體外結(jié)合活性研究。 XXXXX 修飾XXXXXXXXX 對(duì)肝星狀細(xì)胞活化、增殖、XXXXXXX信號(hào)通路影響。 究。 XXXXXXXX 對(duì)膽總管結(jié)扎和CCl4大鼠肝纖維化防治作用。XXXXXXXXX 的藥代動(dòng)力學(xué)特征、組織分布特征和XXXXXXX ： 研究構(gòu)建XXXXXXXX，為抗肝纖維化藥物新劑型開發(fā)提供新型靶向載體。 研究XXXXXX 對(duì)HSC生物活性影響及機(jī)制，為中西藥結(jié)合肝纖維化雙靶向、多靶點(diǎn)、協(xié)同治療提供理論基礎(chǔ)。 研究XXXXXXXX 體內(nèi)HSC靶向性及防治實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的有效性，為開發(fā)中藥新劑型、提高藥物在靶組織濃度、降低有效劑量、減輕副作用和提高療效提供實(shí)踐基礎(chǔ)。 擬解決的關(guān)鍵問題： 高藥物包封率、高配體修飾率的穩(wěn)定XXXXXXXX 制備。放射性計(jì)數(shù)法測(cè)定XXXXXX 與HSC結(jié)合活性，有效抑制HSC活化的劑量、時(shí)間參數(shù)等。 XXXXXX 體內(nèi)HSC靶向性、抗肝纖維化效果比較與評(píng)價(jià)。擬采取的研究方案及可行性分析 研究方案：第一部分 XXXXX 及XXXXX 合成(1)XXXXXX 合成及鑒定采用我們研究室建立的方法，化學(xué)合成XXXXXX。應(yīng)用XXXXXXXXXX。合成反應(yīng)圖示如下。高效液相（HPLC）、質(zhì)譜等方法鑒定合成產(chǎn)物純度及分子量。反應(yīng)圖（略）(2)XXXXXXXXXXX 采用一步法合成。XXXXXXXXXXXX。合成反應(yīng)圖示如下。高效液相（HPLC）和質(zhì)譜分析法進(jìn)物產(chǎn)物純化與鑒定。反應(yīng)圖（略）第二部分 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體制備、鑒定與技術(shù)條件優(yōu)化(1)脂質(zhì)體制備采用經(jīng)我們改良的逆相蒸發(fā)法制備。具體方法如下：XXXXXXXXXX。(2)性質(zhì)鑒定XXXXXXXXXXXXXXXX。(3)均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化處方根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)，確定影響包封率的主要因素。以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用二項(xiàng)逐步回歸計(jì)算回歸方程，并進(jìn)行方差分析，優(yōu)化條件。第三部分 XXXXX修飾長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體與HSC體外結(jié)合活性 采用兩步膠原酶灌注和密度梯度離心法分離大鼠HSC，選擇靜止態(tài)和激活態(tài)的HSC，接種于6孔板上(105/mL)。待貼壁后，1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)過夜，細(xì)胞同步化。(1)配體結(jié)合的濃度效應(yīng)關(guān)系XXXXXXXXXXX。(2)配體結(jié)合的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系XXXXXXXXXXXX。(3)競(jìng)爭(zhēng)抑制XXXXXXXXXX。(4)細(xì)胞熒光定位、配體表面結(jié)合率與內(nèi)吞率測(cè)定XXXXXXXXXX。(5)平衡解離常數(shù)(Kd)和細(xì)胞最大結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(Bmax)XXXXXXXXXXX。第四部分 XXXXXXX對(duì)HSC生物學(xué)特性影響與機(jī)制采用酶法分離大鼠HSC。新鮮分離的HSC，體外培養(yǎng)48 h后，作為靜止期HSC用于下游實(shí)驗(yàn)，或培養(yǎng)1 w后消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，作為活化的HSC用于下游實(shí)驗(yàn)。(1)XXXXXXX對(duì)HSC活化狀態(tài)影響XXXXXXXXX。(2)XXXXXX對(duì)TGFβ1效應(yīng)影響 XXXXXXXXXXXX。(3)XXXXXXXX 大鼠HSC TGFβ受體XXXXXXX 信號(hào)通路影響 XXXXXXXXXXXXXX。第五部分 XXXXXXXXXXXX(1)XXXXXXXX 在肝纖維化大鼠體內(nèi)的器官分布XXXXXXXXXX。(2)XXXXXXX 大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)采用XXXXXXXX。(3)XXXXXXX 在肝纖維化大鼠肝臟內(nèi)分布 采用XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX。第六部分 XXXXXXX防治大鼠肝纖維化(1)造模采用膽總管結(jié)扎和CCl4肝纖維化兩種動(dòng)物模型。(2)分組及處理XXXXXXXXXXXXXX。(3)治療效果檢測(cè)主要比較以下指標(biāo)：XXXXXXXXXXXXXXX。技術(shù)路線圖XXXXXXXXXXXXXXX。 立項(xiàng)依據(jù)有堅(jiān)實(shí)的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。本研究是參閱大量文獻(xiàn)并結(jié)合自身以往深厚的肝纖維化防治研究基礎(chǔ)，特別是結(jié)合近四年國(guó)家自然科學(xué)基金資助研究成果，在XXXX 化學(xué)合成及功能研究、低劑量XXX抗肝纖維化作用和機(jī)制的前期工作基礎(chǔ)上，提出的多途徑、互補(bǔ)協(xié)同與靶向治療肝纖維化的新探索。掌握了國(guó)內(nèi)外在受體調(diào)節(jié)藥物靶向、低毒性高效中藥新劑型開發(fā)和以HSC的靶標(biāo)的肝纖維化靶向治療中的最新研究動(dòng)態(tài)，借鑒“雙靶向”干預(yù)的最新研究成果，并與自身實(shí)踐相結(jié)合，在理論上、實(shí)踐上均有可靠基礎(chǔ)。 相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)成熟，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。本研究使用的實(shí)驗(yàn)方法、動(dòng)物模型和生物分子化學(xué)合成等多為國(guó)內(nèi)外應(yīng)用多年的經(jīng)典方法，并有自身實(shí)踐基礎(chǔ)。本課題組由掌握以上技術(shù)的成員組成，相關(guān)技術(shù)已應(yīng)用于科研工作。 人員配備合理，具有扎實(shí)的相關(guān)工作基礎(chǔ)和完善的實(shí)驗(yàn)設(shè)備及技術(shù)支持。申請(qǐng)人長(zhǎng)期從事肝纖維化防治研究，先后承擔(dān)包括國(guó)家自然基金在內(nèi)的各類科研項(xiàng)目15項(xiàng)，指導(dǎo)或協(xié)助指導(dǎo)博士后、博士生及碩士生70余名。近四年主持了國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“RGD修飾細(xì)胞生物信息調(diào)控分子和綴合基因的功能研究(編號(hào)30170412）”和“人卵泡抑素防治肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究(編號(hào)30170411)”的研究工作，項(xiàng)目組主要成員參與并完成以上研究工作。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指導(dǎo)者、熟練技術(shù)人員及輔助人員等各司其職，可保障研究有條不紊的進(jìn)行。XXXXXXXXX是國(guó)家級(jí)重點(diǎn)學(xué)科和“211”工程重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科的組成單位之一，長(zhǎng)期從事肝纖維化防治研究，先后承擔(dān)包括國(guó)家自然科學(xué)基金在內(nèi)的各級(jí)各類科研項(xiàng)目20余項(xiàng)。本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處 本課題首次嘗試?yán)肵XXXXXX構(gòu)建HSC特異性受體調(diào)節(jié)藥物靶向載體。將新型配體人工化學(xué)合成、受體調(diào)節(jié)藥物靶向技術(shù)與新型脂質(zhì)體載藥技術(shù)三者結(jié)合應(yīng)用于肝纖維化防治，有很強(qiáng)的原始創(chuàng)新性。 本課題首次研究XXXXX生物小分子通過XXXXX與中藥粉防己堿相聯(lián)合，多途徑、互補(bǔ)與協(xié)同防治肝纖維化。本課題是利用分子機(jī)制指導(dǎo)中西藥聯(lián)合應(yīng)用、構(gòu)建中藥靶向制劑提高療效降低副作用和多途徑協(xié)同作用抗肝纖維化的全新嘗試，是在總結(jié)自身工作基礎(chǔ)上進(jìn)行的大膽設(shè)想與創(chuàng)新。研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果 研究計(jì)劃： 預(yù)期研究成果 獲得快速、有效和大量合成XXXXXXX和高藥物包封率、高配體修飾率的穩(wěn)定XXXXXXXX的技參數(shù)，并合成足量研究相關(guān)產(chǎn)物。 體外研究證實(shí)XXXXXXXX。 在體內(nèi)XXXXXXXXX，有效降低有效劑量、提高療效和降低副作用。 研究證實(shí)XXXXXXX可成為抗肝纖維化藥物新劑型開發(fā)的有效載體。（二）研究基礎(chǔ)與工作條件 1 研究基礎(chǔ)。自1981年以來，我們研究室長(zhǎng)期從事肝纖維化防治研究，先后對(duì)鈣拮抗劑、鈣調(diào)蛋白拮抗劑、大黃素、激活素、腎素血管緊張素系統(tǒng)及卵泡抑素等在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行了系列的研究，積累了較豐富的理論，掌握了相關(guān)研究技術(shù)。承擔(dān)了包括國(guó)家自然科學(xué)基金在內(nèi)的各類科研項(xiàng)目20多項(xiàng)，先后獲省部級(jí)以上科技進(jìn)步獎(jiǎng)10項(xiàng)。項(xiàng)目負(fù)責(zé)人率先在我國(guó)開展鈣拮抗劑尤其是中藥粉防己堿對(duì)肝纖維化防治研究，取得豐富的粉防己堿抗肝纖維化基礎(chǔ)和臨床研究成果，在國(guó)內(nèi)外期刊發(fā)表相關(guān)論文50余篇，獲省部級(jí)以上科技進(jìn)步獎(jiǎng)5項(xiàng)。近兩年，我們?cè)谏虾Ｊ薪涛痦?xiàng)目“粉防己堿影響肝星狀細(xì)胞活化信號(hào)分子研究（編號(hào)02BK14）”資助下完成了小劑量粉防己堿抗肝纖維化效果與機(jī)制的研究，在國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道小劑量粉防己堿可通過影響TGFβSmads信號(hào)通路抑制HSC活化，相關(guān)研究論文被SCI收錄(收錄號(hào) IDS Number: 963XN)。該研究為指導(dǎo)粉防己堿在肝纖維化防治中應(yīng)用有重要價(jià)值。（參見申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷及附件二、三）。近四年來，申請(qǐng)人承擔(dān)并完成了國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“RGD修飾細(xì)胞生物信息調(diào)控分子和綴合基因的功能研究（編號(hào) 30170412）”，化學(xué)合成了RGDM6P，分子克隆構(gòu)建pCIRGDSmad7并成功通過脂質(zhì)體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察了RGDM6P和pCIRGDSmad7的生物學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞及動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)pCIRGDSmad7和RGDM6P可減輕ECM沉積，并影響TGFβ1和整合素表達(dá)強(qiáng)度和分布。主要研究工作由本項(xiàng)目組成員參與并完成。目前我們正在利用基金很少量結(jié)余款項(xiàng)進(jìn)行合成RGDM6P修飾SSL的工作。得益于此，他（她）們分別熟練掌握了生物小分子的化學(xué)合成相關(guān)技術(shù)（多肽合成、固相化反應(yīng)、納米技術(shù)、高效分離技術(shù)等）、免疫組織與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、RTPCR和定量PCR、蛋白印跡、高效液相分析、質(zhì)譜分析、肝纖維化動(dòng)物模型及生物信息學(xué)方法等與本課題相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)與方法（相關(guān)論文參見申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷）。由于以上的工作基礎(chǔ)，我們擁有豐富的生物分子合成經(jīng)驗(yàn)，成熟的生物分子構(gòu)建技術(shù)和良好的人員與設(shè)備支持。已經(jīng)構(gòu)建成功的RGDM6P及相關(guān)技術(shù)要領(lǐng)，可直接用于本課題。構(gòu)思本課題的重要原因之一是探討解決簡(jiǎn)單單一藥物治療中發(fā)現(xiàn)的諸多問題而開展的，密切相關(guān)的細(xì)胞學(xué)、動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)也是本實(shí)驗(yàn)成功的重要保證。工作條件