【導(dǎo)讀】內(nèi)蒙古科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)說明書

　　

【正文】 N A D+N A D H2( 或 N A D P )( 或 N A D H2)C O2谷 氨 酸N A D H2N A D+①②③④⑤⑥⑦⑧⑨ 圖 32 由葡萄糖生成 合成谷氨酸的代謝途徑 ①蘋果酸酶；②丙酮酸羧化酶；③丙酮酸脫羧酶；④異檸檬酸脫氫酶； ⑤異檸檬酸裂解酶；⑥α 酮戊二酸脫氫酶；⑦谷氨酸脫氫酶；⑧蘋果酸脫氫酶；⑨乳酸脫氫酶 谷氨酸的發(fā)酵技術(shù) 原料的預(yù)處理 此工藝操作的目的在于初步破壞原料結(jié)構(gòu)，以便提高原料的利用率，同時(shí)去除固體雜質(zhì)，防止機(jī)器磨損。用于除雜的設(shè)備為篩選機(jī)，常用的是振動篩和轉(zhuǎn)筒篩，其中振動篩結(jié)構(gòu)較為簡單，使用方便。用于原料粉碎的設(shè)備除盤磨機(jī)外，還內(nèi)蒙古科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)說明書 17 有錘式粉碎機(jī)和輥式粉碎機(jī)。盤磨機(jī)廣泛用于磨碎大米、玉米、豆類等物料，而錘式粉碎機(jī)應(yīng)用于 薯干等脆性原料的中碎和細(xì)碎作用，輥式粉碎機(jī)主要用于粒狀物料的中碎和細(xì)碎。 淀粉水解糖的制備 在工業(yè)生產(chǎn)上將淀粉水解為葡萄糖的過程稱為淀粉的糖化，所制得的糖液稱為淀粉水解糖。由于谷氨酸生產(chǎn)菌不能直接利用淀粉或糊精作為碳源，因而必須將淀粉水解為葡萄糖，才能供發(fā)酵使用。淀粉水解方法有：酸水解法，酶水解法，酸酶水解法和酶酸水解法。目前，國內(nèi)許多味精廠采用雙酶法制糖工藝，如圖33。 糖化結(jié)束后，將糖化罐加熱至 8085℃ ， 滅酶 30min。過濾得葡萄糖液，經(jīng)過壓濾機(jī)后進(jìn)行油水，再經(jīng)過濾后連續(xù)消毒后進(jìn)入發(fā)酵罐。 淀 粉 調(diào) 漿 配 料 過 濾 液 化 滅 酶 糖 化 滅 酶 壓 濾 糖 化 液濾 渣糖 化 酶堿 液 、 氯 化 鈣 、α 淀 粉 酶 圖 33 雙酶法制糖工藝 種子擴(kuò)大培養(yǎng) 種子擴(kuò)大培養(yǎng)為保證谷氨酸發(fā)酵過程所需的大量種子，發(fā)酵車間內(nèi)設(shè)置有種子站，完成生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)任務(wù)。谷氨酸的發(fā)酵過程為：斜面活化→一級種子培養(yǎng)→二級種子擴(kuò)大培養(yǎng)→發(fā)酵培養(yǎng)。從試管斜面出發(fā)，經(jīng)活化培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)，擴(kuò)大至一級乃至二級谷氨酸發(fā)酵開始前，首先必須配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并對其作高溫短時(shí)滅菌處理。 (1)斜面培養(yǎng)基的組成：葡萄糖 %，牛肉膏 %，蛋白胨 %，氯化鈉%，瓊脂 %， ~。 121℃滅菌 30min(傳代和保藏斜面不加葡萄糖 )。 (2)一級種子培養(yǎng)：種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的是為了獲得大量健壯的細(xì)胞。一級種子培養(yǎng)基應(yīng)該營養(yǎng)豐富，有利于菌體的生長繁殖；其組分與斜面培養(yǎng)基相同。為了避免培養(yǎng)過程中因產(chǎn)生有機(jī)酸引起培養(yǎng)基 pH 下降而造成菌體老化，培養(yǎng)基的含糖量要低，一般在 左右。 內(nèi)蒙古科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)說明書 18 培養(yǎng)條件：在 1000ml 三角瓶中，裝入一級種子培養(yǎng)基 180200ml，滅菌后接種，然后置搖床上，放于搖床上在 30~32℃振蕩培養(yǎng) 10~12h。往復(fù)式搖床的沖程為 ，頻率 100 次 /min。 旋轉(zhuǎn)式搖床偏心距為 5cm，轉(zhuǎn)速為 220r/min。 (3)二級種子培養(yǎng)：通過以及擴(kuò)大，種量還不能滿足發(fā)酵用的需要，因此需進(jìn)一步擴(kuò)大接種量，二級種子培養(yǎng)基的組成與原來一致，但配比上可有差異，這是因?yàn)榭杀ＷC菌種較快適應(yīng)環(huán)境，縮短發(fā)酵周期。 培養(yǎng)條件：二級種子是在種子罐里培養(yǎng)的培養(yǎng)二級種子的接種量為~%，溫度為 32~34℃，培養(yǎng)時(shí)間為 6~8h。種子罐的攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量因種子罐大小而異，如表 34 所示。種子罐的培養(yǎng)基裝量為罐體積的 70%，種子罐的徑高比為 1∶ 2，攪拌器為二檔六彎葉渦輪型，葉徑比為 1∶（ ~） [7]。 表 34 種子罐通風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn) 罐體積 (L) 通風(fēng)量 攪拌轉(zhuǎn)速 (r/min) 50 1∶ 350 250 1∶（ ~） 300 500 1∶ 230 表注： 1∶ 表示 1min 對 1m179。發(fā)酵液通入 179。空氣 （ 4）發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)基不僅提供菌體生長繁殖所需要的營養(yǎng)和能量，而且是形成谷氨酸的物質(zhì)來源。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)含有足夠多的碳源和氮源，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成和配比因菌種、設(shè)備工藝條件和原料來源不同而異。 谷氨酸發(fā)酵 一般認(rèn)定的為無論是 野生株還是突變株，在增值旺盛，進(jìn)行正常代謝的微生物培養(yǎng)液中不存在特生物合成代謝中間產(chǎn)物大量分泌積累的現(xiàn)象。因此為了積累特定的氨基酸，必須用某些方法使微生物代謝調(diào)節(jié)異?；?。谷氨酸產(chǎn)生菌之所以能夠在體外大量積累谷氨酸，首先是菌體的代謝異?；?，即具有一定生理特性的菌株是生產(chǎn)谷氨酸的內(nèi)因和依據(jù)。這種代謝異?；木陮Νh(huán)境條件是敏感的。谷氨酸發(fā)酵是建立在容易變動的代謝平衡上，是受多種條件支配的。 （ 1）發(fā)酵 培養(yǎng)基的控制 與種子培養(yǎng)基不同，發(fā)酵培養(yǎng)基不僅是供給菌體生長繁殖所需要的營和能內(nèi)蒙古科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)說明書 19 源，而且是構(gòu)成谷氨酸的碳架來源，要 積累大量谷氨酸，就要有足夠多的碳源和氮源，其量大大地高于種子培養(yǎng)基，對于菌體繁殖所必需的因子 — 生物素卻要控制其用量。 ①碳源 目前所發(fā)現(xiàn)的谷氨酸產(chǎn)生菌均不能利用淀粉，只能利用葡萄糖、果糖和麥芽糖等，這里主要是將淀粉水解糖作為碳源，培養(yǎng)基中糖濃度對谷氨酸發(fā)酵有很大影響。在一定的范圍內(nèi)，谷氨酸產(chǎn)量隨糖濃度的增加而增加，但是糖濃度過高，由于滲透壓增大，對菌體生長和發(fā)酵都不利。 ②氮源 氮源是合成菌體蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)和合成谷氨酸氨基的來源，同時(shí)，在發(fā)酵過程中一部分氨用于調(diào)節(jié) pH 值，形成谷氨酸銨鹽。因此，谷氨酸 發(fā)酵需要的氮源比一般的發(fā)酵工業(yè)高。碳氮比對谷氨酸發(fā)酵影響很大，在發(fā)酵的不同階段，控制碳氮比以促進(jìn)以生長為主階段向產(chǎn)酸階段轉(zhuǎn)化。氮源有無機(jī)氮和有機(jī)氮，菌體利用無機(jī)氮源比較迅速，利用有機(jī)氮比較緩慢。常用的無機(jī)氮源有尿素、液氨、碳酸氫銨。 ③ 無機(jī)鹽 微生物對無機(jī)鹽的需要量很少，但無機(jī)鹽含量對菌體生長和代謝產(chǎn)物的合成影響很大。磷酸鹽對谷氨酸發(fā)酵影響很大，磷濃度過高時(shí)，菌體的代謝轉(zhuǎn)向合成纈氨酸，但磷含量過低，菌體生長不好；鎂是某些細(xì)菌的葉綠素的組成成分，它的離子狀態(tài)是許多重要的酶的激活劑。鎂離子含量過少，影響基質(zhì)的 氧化。培養(yǎng)基中的硫已經(jīng)在硫酸鎂中供給，不必另加；谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)物生長所需要的鉀鹽比菌體生長需要量高。 ④ 生長因子 以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸產(chǎn)生菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長因子。生物素的作用主要影響谷氨酸產(chǎn)生菌細(xì)胞膜的通透性，同時(shí)也影響菌體的代謝途徑。生物素濃度對菌體生長和谷氨酸積累都影響，大量合成谷氨酸所需要的生物素濃度比菌體生長的需要量低，即為菌體生長需要的“亞適量”。生物素過量，大量繁殖而不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，在生長中表現(xiàn)為長菌快、耗糖快、尿素消耗多、 pH 值低。生物素過量，發(fā)酵向乳酸發(fā)酵轉(zhuǎn)換。供氧充足， 生物素過量，糖內(nèi)蒙古科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)說明書 20 代謝傾向于完全氧化。 （ 2） 青霉素添加的時(shí)間和濃度的控制 青霉素添加的時(shí)間和濃度是影響產(chǎn)酸的關(guān)鍵。在即將添加前半小時(shí)，每隔 5 min 測定 OD、菌體重量、 pH 值等參數(shù)，嚴(yán)密注視該添加的時(shí)間與濃度。一般掌握在發(fā)酵 ～ 、 OD 凈增 ～ 時(shí)，加入青霉素 3～ 5 國際單位 / ml 發(fā)酵液，加入后 OD 值再凈增一倍，菌體經(jīng)過繁殖保持穩(wěn)定。若添加青霉素后， OD控制不住，有時(shí)還需再補(bǔ)加 1～ 2 次適當(dāng)濃度的青霉素。 （ 3） 初糖、接種量和生物素的控制 采用較低初糖（ 8~10%），滲透壓低利于長菌；接種 量大（ 10%）、高生物素（ 50~100 ug /L），使菌生長快，發(fā)酵前期菌體多，添加青霉素后，又同步進(jìn)行生產(chǎn)型，故產(chǎn)酸速度很快。發(fā)酵周期可控制（一般 30~32 h），周期穩(wěn)定，上罐、放罐均可有計(jì)劃進(jìn)行，有利于生產(chǎn)管理和動力平衡。 （ 4） 發(fā)酵過程 pH 值變化及控制 在谷氨酸發(fā)酵過程中，由于菌體對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分的利用和代謝產(chǎn)物的積累，使得培養(yǎng)液的 pH 值不斷變化。在谷氨酸發(fā)酵過程中， pH 的變化是發(fā)酵的重要指標(biāo)。谷氨酸生產(chǎn)菌的最適 pH 值因菌株而異，一般為 ，在中性和微堿性條件下積累谷氨酸，在酸性 條件下形成谷氨酰胺和 N乙酰谷氨酰胺。谷氨酸在發(fā)酵不同階段對 pH 值的要求不同，發(fā)酵前期幼齡菌對氮的利用率高，pH 值變化大。發(fā)酵前期若 pH 值偏低，菌體生長旺盛，消耗營養(yǎng)快，菌體轉(zhuǎn)入正常代謝，繁殖菌體而不產(chǎn)谷氨酸；若 pH 值偏高，抑制菌體生長，糖代謝緩慢，發(fā)酵時(shí)間延長。故谷氨酸發(fā)酵在正常情況下，為了保證足夠的氮源，發(fā)酵前期控制 pH 值 左右，發(fā)酵中期控制 pH 值 左右，發(fā)酵后期控制 pH值 ，放罐時(shí) pH 值 ～ 。在發(fā)酵過程中根據(jù) pH 值變化流加液氨或氨水調(diào)節(jié) pH值， 保持一定的 NH4+/GA 比 ， 同時(shí)作為氮源。 （ 5）發(fā)酵 過程溫度的控制 谷氨酸生產(chǎn)菌的最適宜生長溫度為 30~34℃ ，發(fā)酵產(chǎn)酸的最適宜溫度為34~38℃ 。若長菌期溫度偏高，菌體在短時(shí)間生長可能會快，但容易衰老，表現(xiàn)為 OD 值增長不高，前期短時(shí)間內(nèi)耗糖快，很快耗糖速度下降，發(fā)酵周期長，谷氨酸生產(chǎn)少；若長菌期溫度偏低，菌體生長緩慢，導(dǎo)致發(fā)酵周期長。必要時(shí)可以內(nèi)蒙古科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)說明書 21 加玉米漿來促進(jìn)生長。一般控制在發(fā)酵開始的溫度上，每隔 56h 升 1℃ 即可。在發(fā)酵中期、后期菌體生長已停止，由于谷氨酸脫氫酶的最適宜溫度比菌體生長繁殖的溫度高，為促進(jìn)產(chǎn)酸性細(xì)胞積累谷氨酸，需要 適當(dāng)提高溫度，有利于提高谷氨酸產(chǎn)量。 （ 6） 定容的控制 開始定容 45～ 50%，以便留出較大的流加糖空間，最后定容至 80%。 （ 7） 通氣量與 總 △ OD 的控制 在菌體生長期，供氧必須滿足菌體呼吸的需氧量。供氧量不足，菌體呼吸受到抑制而影響生長。但通氣量并非越大越好。當(dāng)菌體生長速度達(dá)最大值，如果再提高供氧，不但造成浪費(fèi)，而且由于高氧水平抑制生長且不能有效地產(chǎn)生谷氨酸。只要根據(jù)細(xì)胞繁殖數(shù)量的增加適當(dāng)增加供氧即可。與菌體生長期相比，谷氨酸生產(chǎn)期需要大量的氧氣，谷氨酸發(fā)酵在細(xì)胞最大呼吸速率時(shí)，谷氨酸產(chǎn)量大，因此，在谷氨酸 生產(chǎn)期要求充分供氧，以滿足細(xì)胞最大呼吸的需氧量。 發(fā)酵前期，采用低風(fēng)量較宜；發(fā)酵中期以高風(fēng)量為宜；發(fā)酵后期又適當(dāng)減少風(fēng)量，以促進(jìn)產(chǎn)生的 α酮戊二酸還原氨基轉(zhuǎn)化成谷氨酸，當(dāng)殘?zhí)墙档?1%，可將通風(fēng)量降到最低，以促進(jìn)中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)換成谷氨酸。 發(fā)酵過程最好實(shí)現(xiàn)自動化。如不能實(shí)現(xiàn)，隨時(shí)測定排氣 CO2， CO2 宜控制在12～ 13%左右， 發(fā)酵后期可降到 10%，最后放罐前也要控制在 8%，決不能降到0，不能太低，否則通氣量過大 而影響產(chǎn)酸 。人工控制操作，可采用梯形控制，兩頭小中間大，開始分 2~3 次提風(fēng)， △ OD 為 時(shí)提一次風(fēng)， △ OD 為 ～ 時(shí)添加青霉素后提一次風(fēng)， △ OD 為 ~ 時(shí)再提至最大風(fēng)量。 20~22 h 降一次風(fēng)， 24~26 h 降一次風(fēng)， 28 h 再降一次風(fēng)?？?△ OD 控制在 ~。 （ 8） 泡沫的控制 在谷氨酸發(fā)酵中，由于通氣攪拌與菌體代謝產(chǎn)生的 CO2，使得培養(yǎng)液中產(chǎn)生大量泡沫，目前消除泡沫大多采用機(jī)械消泡器與消泡劑相結(jié)合的消泡方法。通常采用基礎(chǔ)料中加入消泡劑與中間流加消泡劑相結(jié)合的方法來控制泡沫。在基礎(chǔ)料中加入消泡劑主要起抑制泡沫的作用，在發(fā)酵培養(yǎng)基配置時(shí)加入 %的消泡劑，連同培養(yǎng)基一起滅菌。在 發(fā)酵過程中，采用中間流加消泡劑的方法。即先將消泡劑配置一定濃度，經(jīng)過滅菌、冷卻，當(dāng)發(fā)酵過程產(chǎn)生泡沫時(shí)間歇流加進(jìn)入發(fā)酵罐。盡量少加，每次流加量以能夠把泡沫消除為宜。 內(nèi)蒙古科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)說明書 22 （ 9） 流加糖的控制 采用適當(dāng)初糖濃度，在發(fā)酵過程中流加葡萄糖，有利于菌體生長和谷氨酸生產(chǎn)，從而提高單位發(fā)酵容積的產(chǎn)量。一般生產(chǎn)上流加糖濃度范圍是 280600g/L，選擇流加糖的濃度要結(jié)合接種量、生物素濃度、發(fā)酵初糖濃度及發(fā)酵初始體積進(jìn)行綜合考慮。 流加的方法有間歇流加法和連續(xù)流加法。間歇流加法一般在發(fā)酵殘?zhí)菨舛葹?050g/L 時(shí)進(jìn)行第一次流加 ，流加糖量控制在使殘?zhí)菨舛壬仙?2030g/L 為宜，由于菌體不斷耗糖，當(dāng)殘?zhí)橇肯陆档揭欢舛葧r(shí)再進(jìn)行流加。通常發(fā)酵中期控制流加糖以后的殘?zhí)菨舛仍?3060g/L，并且使殘?zhí)菨舛扔兄鸩较陆档内厔荩桨l(fā)酵后期控制流加糖以后的殘?zhí)菨舛仍?2030g/L，注意最后一次流加的時(shí)間和流加的量，確保發(fā)酵放罐時(shí)殘?zhí)窃?4g/L 以下，才有利于谷氨酸提取和不會造成葡萄糖的浪費(fèi)。連續(xù)流加法一般在發(fā)酵殘?zhí)菨舛葹?1015g/L 時(shí)開始流加糖，用流量計(jì)計(jì)量流量，控制流加糖的流量，使殘?zhí)菨舛染S持在 1015g/L，在 發(fā)酵 結(jié)束前的最后 12h 停止流加，讓菌體消耗掉殘?zhí)?，確保發(fā)酵放罐時(shí)殘?zhí)?在 4g/L 以下。連續(xù)流加法可實(shí)現(xiàn)優(yōu)化控制。 谷氨酸的提取 谷氨酸的提取一般采用低溫等電點(diǎn) 離子交換法，國內(nèi)有些味精廠還采用等電點(diǎn) — 鋅鹽法、鹽酸水解 — 等電點(diǎn)法及離子交換膜電滲析法提取谷氨酸。但存在廢水污染大，生產(chǎn)成本高，技術(shù)難度大等問題，應(yīng)用上受到限制。 低溫等電點(diǎn) — 離子交換法 提取谷氨酸是在發(fā)酵液經(jīng)等電點(diǎn)提取谷氨酸以后，將母液通過離子交換柱進(jìn)行吸附，洗脫回收，使洗脫所得的高流分與發(fā)酵液合并，進(jìn)行等電點(diǎn)提取?；厥章士蛇_(dá) 95%左右。其工藝流程圖見圖 35。 內(nèi)蒙古科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)說明書 23 發(fā) 酵 液調(diào) 酸起 晶停 酸 攪 拌 育 晶 2 h緩 慢 調(diào)