【正文】 ltingin) 。 任何物質(zhì)的溶解度都取決于溶質(zhì)分子間的相對親和力及溶質(zhì)分子與溶劑分子的相對親和力。任何降低溶質(zhì)分子相互作用的因素以及加強溶質(zhì)分子與溶劑分子相互作用的因素都有助于增加溶解度。 鹽析現(xiàn)象： 隨著鹽濃度的繼續(xù)升高，例如，達到飽和和半飽和的程度，蛋白質(zhì)的溶解度逐漸變小，彼此之間相互凝聚而發(fā)生沉淀，此現(xiàn)象稱作 鹽析 (sattingout) 。 離子強度 (μ) ＝ ΣCZn21/2 三、 蛋白質(zhì)的沉降作用及超離心分離 沉降速度 (ν = dx / dt )與蛋白質(zhì)分子的大小和密度有關(guān)。 沉降速度法 ，適用于分離沉降系數(shù)不同但密度相近的蛋白質(zhì)。 沉降平衡法 ，適用于沉降系數(shù)相近，但密度不同的蛋白質(zhì)。 沉降系數(shù)： 當(dāng)沉降界面以恒定的速度移動時，單位離心場里的沉降速度。 四. 凝膠過濾 五. 是指利用高度水化的，具有不同大小孔徑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的惰性多聚物顆粒作為層析柱的填充物，把分子大小不同的蛋白質(zhì)混合物上樣到柱層析上，混合物中的各組分隨著洗脫液的流動，按分子大小以不同的速度向下移動，從而把各組分分開 （圖 249） 。 常用的有葡聚糖凝膠 (sephadex,)或瓊脂糖凝膠(sepharose) 作為層析柱的填充物 。 五、蛋白質(zhì)的配體特異性與親和層析 根據(jù)蛋白質(zhì)的配體特異性，建立了一種非常有效的蛋白質(zhì)分離方法 ——親和層析法 。假如某蛋白質(zhì) A，在表現(xiàn)功能的過程中需要和 B物質(zhì)結(jié)合，且結(jié)合是特異的： A + B＝ AB 假若用化學(xué)的方法先將 B物質(zhì)與一種不溶性載體 (R) 偶聯(lián)，得到 RB，偶聯(lián)到 R上的 B不喪失與 A結(jié)合的能力的話，那麼，將含有 A的混合蛋白通過裝有 RB的層析柱時， A將與 B結(jié)合 , 形成 R－ BA，不能與 B結(jié)合的雜蛋白將從柱下流出 , 然后用適當(dāng)?shù)南疵撘簩?A洗脫下來。 練習(xí)題 1. 某種蛋白質(zhì)當(dāng)用凝膠過濾法測定其分子量為 90kD，而用SDSPAGE測定其分子量為 60kD，無論是否有巰基乙醇存在都如此。為什么會有二種不同的結(jié)果？你認為哪種方法更準確？ 2. 從下面的信息確定某一蛋白質(zhì)亞基組成： 1). 用凝膠過濾法，測定其分子量為 200kD， 2). 用 SDSPAGE，測定其分子量為 100kD， 3). 在巰基乙醇存在下，用 SDSPAGE分析，獲得的分子量 為 60kD和 40kD. 3. 1). 是 Trp還是 Gln更有可能出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的表面？ 2). 是 Ser還是 Val更少可能出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的內(nèi)部？ 3). 是 Leu還是 Ile更少可能在 αLelix的中間部位找到？ 4). 是 Cys還是 Ser更有可能出現(xiàn)在 βSheet中？ 4. 在生理條件下，多聚賴氨酸呈隨機卷曲的構(gòu)象，在什么樣 的條件下，它可以形成 αhelix？ Chapter 3. 酶 (Enzyme) Section 1 酶 的 基 本 性 質(zhì) 一、酶是生物催化劑 酶是生物細胞產(chǎn)生的、以蛋白質(zhì)為主要成分的、能加快化學(xué)反應(yīng)速度、使之迅速達到平衡、但不改變反應(yīng)的平衡常數(shù)的生物催化劑。酶的催化活性受多種因素調(diào)節(jié)控制。 二、酶能快細胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)速度 按照能量學(xué)的觀點 ,一個化學(xué)反應(yīng)并不是從反應(yīng)物直接向產(chǎn)物生成的方向進行的。 反應(yīng)的發(fā)生 ,即產(chǎn)物的生成取決于過渡態(tài)或轉(zhuǎn)換態(tài) (transition state)的能量狀況 。只有當(dāng)反應(yīng)物在空間定向上有利于反應(yīng)以及反應(yīng)物達到轉(zhuǎn)換態(tài)所需的能量（即是否處在化學(xué)鍵的斷裂或形成所需的范圍內(nèi)）時，反應(yīng)才能發(fā)生。 很顯然 , 轉(zhuǎn)換態(tài)越能有效的達到，反應(yīng)的速度就越大。 如 圖 3— 1所示 ,反應(yīng)物從基態(tài)轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)換態(tài)的能量差值稱為活化能 (△G?)。 毫無例外 , 每一種化學(xué)反應(yīng)都有一個 △G?。 根據(jù)轉(zhuǎn)換態(tài)的理論，一種催化劑的作用在于以某種途徑降低反應(yīng)的活化能而增高化學(xué)反應(yīng)速度。 因此，在有催化劑存在的情況下，轉(zhuǎn)換態(tài)能比較有效地達到，從而增高反應(yīng)的速度。典型的酶促反應(yīng)速度比無催化劑存在的反應(yīng)要高出 106～ 1012倍。 三、酶不能改變化學(xué)反應(yīng)的平衡 反應(yīng)速度和反應(yīng)平衡之間有著重要的差別。 催化劑的功能是增高反應(yīng)的速度，而不會改變反應(yīng)的平衡。酶的存在，象其他催化劑一樣，只能降低達到轉(zhuǎn)換態(tài)所需的活化能而不能改變反應(yīng)的平衡，它唯一的作用是加速反應(yīng)物和產(chǎn)物的相互轉(zhuǎn)化。在反應(yīng)中，酶不會被消耗，平衡點不會改變，但達到平衡的速度則要快得多。 反應(yīng)的平衡與△ G0′ （產(chǎn)物與反應(yīng)物所固有的標準自由能之差）有著密切的關(guān)系，但反應(yīng)速度則與△ G?有關(guān)。 四、酶的催化反應(yīng)具有專一性 酶對所催化的底物具有不同程度的選擇性。 某一種酶往往只能對某一類物質(zhì)起作用，或者只對某一種物質(zhì)起催化作用。一般無機催化劑對它們所作用的底物沒有這種嚴格的選擇性。 五 、 酶的組成 1．酶的組成 ●由單純蛋白質(zhì)所構(gòu)成的酶 ●由蛋白質(zhì)和其他成分構(gòu)成的酶 :除了蛋白質(zhì)成分 (即 酶蛋白apoenzyme)外，還含有一些對熱穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)小分子物質(zhì) (即 輔助因子 cofactor)。 輔助因子 分 輔酶和輔基 (coenzyme prosthetic group)， 它們是這類酶的催化活性的必要條件，缺少它們，酶的催化作用就會消失。 、結(jié)合部位和催化部位 酶的活性中心通常是指酶分子上直接與底物結(jié)合并與催化作用直接有關(guān)的部位，是由酶分子上的某些氨基酸殘基的側(cè)鏈基團共同構(gòu)成。 酶的 活性中心可分兩部分： 參與和底物結(jié)合的 結(jié)合部位 (binding site) 及直接參與催化反應(yīng)的 催化部位 (catalytic site) 。 兩者對酶活性都是必須的，前者決定酶的專一性，后者決定酶的催化能力。 六、某些 RNA具有催化活性 長期以來 ,人們都認為所有的酶都是蛋白質(zhì) .但是近 20年來，越來越多的例子表明某些 RNA分子也是生物催化劑。這些 具有催化活性的 RNA，叫做 Ribozyme，意即酶活性 RNA。 例如 ,RNase P是一種與 tRNA前體加工成 tRNA反應(yīng)有關(guān)的酶。， 在體外， 單獨的蛋白質(zhì)組分不能催化 tRNA前體轉(zhuǎn)變成 tRNA，而 RNA組分在適當(dāng)?shù)臈l件下能完成這種轉(zhuǎn)變反應(yīng)。另外一個例子是 四膜蟲 26S rRNA前體中的插入順序的切除與兩端片段的正確拼接不需要蛋白質(zhì)的催化，是一種自我剪接的過程。該過程需要鳥苷或者鳥苷酸的存在 .在體內(nèi)，這種剪接方式可能只進行一次， 但在體外， 他象一種真正的酶一樣能作用多次。 ,肽鍵的形成很可能是 50S核糖體亞基催化的。催化這一反應(yīng)的酶叫做肽基轉(zhuǎn)移酶。當(dāng)把所有的蛋白質(zhì)組分從 50S核糖體亞基中去除后， 23S rRNA能催化這一肽鍵的形成反應(yīng) (圖 3— 2). 七、催化抗體 抗體酶 抗體是免疫球蛋白。催化抗體 (catalytic antibodies)又叫做抗體酶 (abzymes)。象其它抗體一樣 , 抗體酶也是一種生物對叫做抗原 (antigen)的某種外源分子作出應(yīng)答的產(chǎn)物 , 只是這種抗原分子被有目的地改造成某種反應(yīng)的轉(zhuǎn)換態(tài)中間物。 推理是： 一種能專一同某反應(yīng)的轉(zhuǎn)換態(tài)中間物結(jié)合的蛋白質(zhì)，必定能啟動正常反應(yīng)物進入到活潑的轉(zhuǎn)換態(tài)構(gòu)象。因此 , 一種催化抗體便能促使它的底物形成轉(zhuǎn)換態(tài)構(gòu)象，從而加速這一反應(yīng)。常規(guī)酶最顯著的催化效力是因為它們對所催化的反應(yīng)轉(zhuǎn)換態(tài)中間物有很高的親和力，因而抗體酶同它的專一性底物（抗原）必定有很高親和力。 Section 2. 酶的命名與分類 一 . 命名原則 例如：乙醇脫氫酶 1).應(yīng)標明酶的所有底物及催化的性質(zhì)，并用 : 符號把底物分開。例如：乙醇： NAD+脫氫酶 . 2).不管催化正反應(yīng)還是逆反應(yīng)，一般都用同一名稱。 3).如果所催化的反應(yīng)包含二種變化，則盡可能用同一種變化 來表示 ,另一個功能附后。 例如： L谷氨脫氫酶催化的反應(yīng)是： （圖 33） 谷氨酸： NAD+脫氫酶 (脫氨 )。 二 .酶的分類 (圖 33) : 催化氧化還原反應(yīng)： A2H + B → A + B 可分為 需氧脫氫酶、氧化酶 和 不需氧脫氫酶 。 (transferanses)： 催化功能基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng)： AB + C ←→A + BC (hydrolases): 催化水解反應(yīng) :AB + HOH →AOH + BH (lyases)： 催化底物裂解反應(yīng)，并產(chǎn)生雙鍵，或其 逆反應(yīng)，將一個基團加到雙鍵上： AB ←→ A + B 例如： （圖 34） (isomerases)：催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變： A ←→ B 如異構(gòu)酶和消旋酶催化的反應(yīng)。 (連接酶 )類 (ligases)： 這類酶催化一切必須與 ATP分解相聯(lián)，并由二種物質(zhì)合成一種物質(zhì)的反應(yīng)： A + B + ATP → AB + ADP + Pi( 或 AMP + PPi) 例如谷氨酰胺合成酶催化的反應(yīng)： （圖 33） Section 3 酶反應(yīng)動力學(xué) 一、酶活力與酶的反應(yīng)速度 要檢查酶的存在及含量 , 不能直接用重量或體積來表示 , 要根據(jù)酶引起的某一特定的化學(xué)反應(yīng)的能力來表示 , 即用酶的活力來表示 . 酶活力的高低是研究酶的特性、進行酶制劑的生產(chǎn)及應(yīng)用時的一項不可缺少的指標 .酶活力又叫酶活性 (activity)是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力 . 酶反應(yīng)速度可以用單位時間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量表示 , 即用 : d[s]/d[t] 或 d[p]/d[t] 表示 . 研究酶反應(yīng)速度或測定酶的活性應(yīng)以酶促反應(yīng)的初速度(initial rate)為準 .初速度是指在酶濃度底物濃度一定的條件下 , 在最初一段時間內(nèi) , 產(chǎn)物的濃度隨時間的增加而成比例的增加時的速度 （圖 36） 。 2. 酶的活力單位 . 國際酶學(xué)委員會規(guī)定 , 一個酶活力單位 (unit,u) 是指在 25℃下 , 其它條件如 pH及底物濃度均采用最適條件 , 在 1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1μ mol底物的酶量 (或轉(zhuǎn)化 1μ mol底物的有關(guān)基團的酶量 ).但是，酶的活力單位常根據(jù)實際需要來規(guī)定。 酶的比活力 (specific activity) 比活力 是指每 mg蛋白質(zhì)所具有的活力單位數(shù) , 即 活力單位數(shù)/mg蛋白質(zhì) . 在酶的純化過程中 , 每步純化后都要測定酶的比活力 , 比活力高 , 表明酶的純度高。 酶的純度是用比活力表示的 ： 比活力 = 活力單位數(shù) /mg蛋白 = 總活力單位數(shù) /總 mg蛋白 . 例如 , 某酶經(jīng)過四個純化步驟后 , 獲得如下的數(shù)據(jù) : 純化步驟： Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 總活力： 6 4 3 2 總蛋白： 20 10 5 2 比活力： 6/20 4/10 3/5 2/2 在提純中，總活性在減少，總蛋白也在減少，但比活性在提高。 此外 , 在酶的純化工作中還要計算兩個具有實際意義的項目 , 即 純化倍數(shù)和回收率 (產(chǎn)量 %)： 純化倍數(shù) = 每次比活力 /第一次比活力 回收率 （產(chǎn)量 %） =(每次的總活力 /第一次總活力 )100 二 、酶反應(yīng)的基本動力學(xué) 酶動力學(xué)研究的是酶催化反應(yīng)的速度，描述酶作為催化劑的生物學(xué)作用 , 描述酶是怎樣完成它們所催化的反應(yīng)。由于酶的最基本特性就是加快生物化學(xué)反應(yīng)速度，因此，所有酶的催化反應(yīng)速度以及它們的催化效率都是可以定量的。這就是酶促反應(yīng)動力學(xué)研究的基本內(nèi)容。 1. 底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響 . 底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響如 圖 37所示。 1) 中間產(chǎn)物學(xué)說 酶動力學(xué)研究始于 1902年，當(dāng)時， β 呋喃果糖糖苷酶對蔗糖進行水解。他發(fā)現(xiàn)當(dāng)蔗糖的濃度比酶的濃度高許多時，反應(yīng)速度不再取決于蔗糖的濃度，即是說，反應(yīng)速度相對于蔗糖來說是零級反應(yīng)。因此，他提出，蔗糖水解的總反應(yīng)是由兩個基本反應(yīng)構(gòu)成， 第一步是底物與酶形成一種復(fù)合物，第二步是這種中間物生成產(chǎn)物并釋放出酶 : k1 k2 E + S ←→ ES → P + E k1