【正文】 體化合物的 缺陷 型；第八章微生物的遺傳組 合 營 養(yǎng)物法步驟（以氨基酸缺陷型的鑒定為例）：a. 將多種 營 養(yǎng)因子 編組 ；b. 將 組 合液的 紙 片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)；c. 結 果分析； 一 組 ： 1 2 3 4 5 二 組 ： 2 6 7 8 9 三 組 ： 3 7 10 11 12 四 組 ： 4 8 11 13 14 五 組 ： 5 9 12 14 15營 養(yǎng)因子分 組編 排 時注意；1）每 組 內(nèi)無重復的營 養(yǎng)因子 2）每 組 中 應 包含只出 現(xiàn) 一次的因子 3）每 組 中其他因子應 分 別 出 現(xiàn) 二次如：第八章微生物的遺傳 一 組 ： 1 2 3 4 5 二 組 ： 2 6 7 8 9 三 組 ： 3 7 10 11 12 四 組 ： 4 8 11 13 14 五 組 ： 5 9 12 14 15第八章微生物的遺傳② 組合補充培養(yǎng)基法–將待測的菌點種到各種補充培養(yǎng)基上，逐個分析各菌的 缺陷類型，或快速分離出所需 缺陷 類型的菌株。ABFEDCH G第八章微生物的遺傳缺陷型 的應用v作 為 菌株的 遺傳標記 ： 進 行基因工程、 誘變 育種、v研究代 謝過 程 時 用作 親 本 標記 ；v作 為 生 產(chǎn) 菌種： aa、核苷酸等生 產(chǎn) 菌種； v作 為 aa、 維 生素、堿基的 測 定菌株。第八章微生物的遺傳Ames test：對化學誘變劑做檢測菌種：鼠 傷寒沙 門 氏菌 his ； 原理： his 在基本培養(yǎng)基上不 長 ；而 發(fā)生回復突 變則長 。第八章微生物的遺傳Ames test 方法示意圖第八章微生物的遺傳第三節(jié) 基因重組| 定義：凡把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組（ gene rebination）或遺傳重組。| 作用：重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個體。| 重組與雜交的關系：I重組是分子水平上的一個概念，可以理解成是遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交而一般所說的雜交（ hybridization）則是細胞水平上的一個概念。I雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交這一形式。I真核微生物中的有性雜交、準性雜交（ parasexual hybridization）等及原核生物中的轉化、轉導、接合和原I生質(zhì)體融合等都是基因重組在細胞水平上的反映。第八章微生物的遺傳微生物中各種形式基因重組的比較重組范圍供體和受體的關系 整套染色體 局部雜合高頻率 低頻率 部分染色體 個別或少數(shù)基因細胞融合或聯(lián)結性細胞真菌的有性生殖體細胞真菌的準性生殖細胞間暫時溝通 細菌的接合 性導細胞間不接觸吸收游離DNA片段轉化噬菌體攜帶DNA轉導由噬菌體提供遺傳物質(zhì)完整噬菌體溶源轉變噬菌體 DNA 轉染第八章微生物的遺傳基因重組的意義| 基因重組是雜交育種的理論基礎。| 雜交育種的優(yōu)點： ① 由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本，因此，不論在方向性還是自覺性方面，均比誘變育種前進了一大步。| ② 利用雜交育種往往還可以消除某一菌株在經(jīng)過長期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，因此，它是一種重要的育種手段。| 雜交育種的缺點： 由于雜交育種的方法較復雜，工作進展較慢，還很難像誘變育種技術那樣得到普遍的推廣和使用，尤其在原核生物的領域中，應用轉化、轉導或接合等重組技術來培育可應用于生產(chǎn)實踐上的高產(chǎn)菌株的例子還不多見。到了 70年代后期，由于原生質(zhì)體融合技術獲得巨大的成功后，才使重組育種技術獲得了飛速的發(fā)展。第八章微生物的遺傳生 長 快、 產(chǎn) 量低生 長 慢、 產(chǎn) 量高基因重 組生 長 快、 產(chǎn) 量高第八章微生物的遺傳一、原核微生物的基因重組| 基因重組的方式z轉化z轉導z接合z原生質(zhì)體融合第八章微生物的遺傳 R型活菌 +S型死菌 → →S 型活菌216。定義 ： 受體菌自然或在人工技術作用下直接攝取來自供體菌的游離 DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉移過程，稱為轉化。轉化后的的受體菌稱為 轉化子（ transformant）。216。有關名詞：216。受體菌： recipient/receptor，轉化基因的接受者216。供體菌： donor，轉化基因的提供者216。轉化因子： 來自供體菌的 DNA片段216。轉化子 ： transformant，將轉化基因重組進入自身染色體組的重組子（一）轉化（ transformation）轉化及其發(fā)現(xiàn)第八章微生物的遺傳 ① 受體細胞要處于感受態(tài) .216。感受態(tài) ： petence，受體細胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實現(xiàn)其轉化的一種生理狀態(tài)② 供體 DNA片段（ 轉化因子 ）大小適宜，分子量一般為1 107 D 左右 ③ 菌株間的親緣關系密切轉化發(fā)生的條件 轉化的類型根據(jù)感受態(tài)建立的方式，可以分為：① 自然遺傳轉化 natural geic transformation② 人工轉化 artificial transformation第八章微生物的遺傳 感受態(tài)| 出現(xiàn)時間： 只在細菌生長的某一時期出現(xiàn)；不同菌種的感受態(tài)出現(xiàn)在不同生長時期z Streptococcus pneumoniae的感受態(tài)出現(xiàn)在生長曲線中的指數(shù)期的中期，z Bacillus的一些種則往往出現(xiàn)在指數(shù)期末及穩(wěn)定期的初期。z 感受態(tài)由細胞的遺傳性決定，但同時也受環(huán)境因子的影響：cAMP、 Ca2+等最明顯。如用 CaCl2 處理 E. coli可以誘發(fā)其產(chǎn)生感受態(tài)。| 感受態(tài)細胞的比例： 當處于感受態(tài)高峰時，群體中呈感受態(tài)的細胞因菌種而不同 .z Bacillus subtilis不超過 10~15%z Streptococcus pneumonia和 Haemophilus influenzae（流感嗜血桿菌）達到 100%| 轉化 DNA的最低濃度： 在群體中含有 15% 感受態(tài)細胞時，?gDNA/ml細胞懸液即可有效發(fā)生轉化第八章微生物的遺傳感受態(tài)因子： 細胞外蛋白， Streptococcus pneumonia和 Bacillus中分離的分子量為5,000~10,000Dalton，可能存在于細胞膜上，可催化外來 DNA分子的吸收或降解細胞表面某種成分，以讓細胞表面的 DNA受體顯露出來；也可能是一種自溶酶。對不同細菌，每個細胞上的 DNA結合位點數(shù)不同。有人計算，在 H. Influenzae上有 4~10個，而在 S. Pneumonia上則有 30~80個。 S. Pneumonia的感受態(tài)細胞中提取的感受態(tài)因子可使同菌株的非感受態(tài)細胞變成感受態(tài)的，而 Bacillus subtilis的感受態(tài)因子則無此功能。第八章微生物的遺傳轉化因子| 轉化因子：本質(zhì)是供體 DNA片段z 一般的轉化因子都是線狀雙鏈 DNA；也有少數(shù)報道認為線狀單鏈 DNA也有轉化作用。z 大?。航?jīng)過多次提純操作后，每一轉化 DNA片段的分子量都小于 1107，即約占細菌核染色體組的 % ，其上平均約含 15個基因。而粗制的 DNA則分子量較大。z 吸收數(shù)量：每個感受態(tài)細胞約可摻入 10個轉化因子。z 轉化頻率： 一般只有 ~1% ，最高時亦達 10% 左右。據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式 （雙 鏈閉 合 環(huán) 狀） 的轉化因子，其轉化頻率最高（因為它進入受體菌中后，可不必與受體染色體進行交換、整合即可進行復制和表達）。第八章微生物的遺傳轉化的過程以 S. Pneumonia strr（肺炎鏈球菌抗鏈霉素菌株）為例，大致可分為六階段：吸附： 雙鏈 DNA片段與細胞表面的特定位點（主要在新形成細胞壁的赤道區(qū)）結合，此時，細胞膜上的膽堿可促進這一過程。在吸附過程的前階段，如外界加入 DNA酶，就會減少轉化子的產(chǎn)生。稍后， DNA酶即無影響，說明此時該轉化因子已進入細胞；切割： 在吸附位點上的 DNA被核酸內(nèi)切酶分解，形成平均分子量為4~5106的 DNA片段；入胞： DNA雙鏈中的一條單鏈被膜上的另一種核酸酶切除，另一條單鏈逐步進入細胞，這是一個耗能的過程。分子量小于 5105的DNA片段不能進入細胞。這時如用低濃度溶菌酶處理，因它提高了細胞壁的通透性，故可提高轉化頻率；重組： 來自供體菌的單鏈 DNA片段在細胞內(nèi)與受體細胞核染色體組上的同源區(qū)配對，接著受體染色體組上的相應單鏈片段被切除，并被外來的單鏈 DNA交換、整合和取代，于是形成了一個雜合 DNA區(qū)段（ heterozygous region）。在這一過程中，有核酸酶、 DNA聚合酶和 DNA連接酶的參與；復制 ：受體菌的染色體組進行復制，雜合區(qū)段分離成兩個，其中之一獲得了供體菌的轉化基因，另一個未獲供體基因；轉化子形成： 當細胞發(fā)生分裂后，一個子細胞含供體基因，這就是轉化子；另一個細胞與原始受體菌一樣。第八章微生物的遺傳降解吸附切割成 4~5106單鏈入胞同源部分配對、整合復制分裂，只有一個子代DNA分子獲得供體基因非轉化子 轉化子第八章微生物的遺傳轉化的過程strrstrr第八章微生物的遺傳自然轉化的普遍性 到目前為止，已發(fā)現(xiàn)能發(fā)生轉化作用的菌屬主要有：4 Streptococcus pneumoniae、 Haemophilus（嗜血桿菌屬）、 Bacillus、 Neisseria（奈瑟氏球菌屬）、 Rhizobium（根瘤菌屬）、 Staphylococcus、 Pseudomonas和Xanthomonas中多見。4 在若干放線菌和藍細菌以及 Saccharomyces cerevisiae、 Neurospora crassa（粗糙脈胞菌）和 Aspergillus niger中，也有轉化現(xiàn)象。4 腸桿菌科的一些細菌很難進行轉化，主要原因一方面由于外來 DNA難以摻入到細胞中，另一方面在受體細胞內(nèi)常存在可降解線形 DNA的核酸酶。如果用 CaCl2處理 E. coli的球狀體，就可以使之發(fā)生低頻率的轉化。另外，可利用霉菌的原生質(zhì)體進行轉化。4 兩個菌種或菌株之間能否發(fā)生轉化，與它們在進化過程中的親緣關系有著密切的關系。但即使在轉化率極高的菌種中，其不同菌株間也不一定都能發(fā)生轉化。第八章微生物的遺傳人工轉化 人工轉化 —— 是通過人為誘導的方法，使細胞具有攝取 DNA的能力，或人工地將 DNA導入細胞內(nèi)。 方法：① CaCl2處理細胞，使其成為能攝取外源 DNA的感受態(tài)狀態(tài) .② 電穿孔法 electroporation：用高壓脈沖電流擊破細胞膜，或擊成小孔，使各種大分子（包括 DNA ）能通過這些小孔進入細胞。第八章微生物的遺傳可轉化的形狀莢膜多糖的合成專一性酶的合成專一性蛋白質(zhì)的合成抗藥性第八章微生物的遺傳 （ transfection）| 定義：z 把噬菌體或其它病毒的 DNA（或 RNA）抽提出來，讓它去感染感受態(tài)的宿主細胞，并進而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒的后代，這種現(xiàn)象稱為轉染（ transfection）。| 與轉化的區(qū)別：z 病毒或噬菌體并非遺傳基因的供體菌z 中間不發(fā)生任何遺傳因子的交換或整合z 最后不產(chǎn)生具有雜種性質(zhì)的轉化子第八章微生物的遺傳[173。][173。][173。]Try173。his+ Try+his173。Try+his+混合培養(yǎng)A B三、轉導（ transduction）（ 1952）在 Salmonella typhimurium（鼠傷寒沙門氏菌）中發(fā)現(xiàn)的。 第八章微生物的遺傳A B[173。] [173。]Try+his+Try173。hi