【正文】 體化合物的 缺陷 型；第八章微生物的遺傳組 合 營(yíng) 養(yǎng)物法步驟（以氨基酸缺陷型的鑒定為例）：a. 將多種 營(yíng) 養(yǎng)因子 編組 ；b. 將 組 合液的 紙 片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)；c. 結(jié) 果分析； 一 組 ： 1 2 3 4 5 二 組 ： 2 6 7 8 9 三 組 ： 3 7 10 11 12 四 組 ： 4 8 11 13 14 五 組 ： 5 9 12 14 15營(yíng) 養(yǎng)因子分 組編 排 時(shí)注意；1）每 組 內(nèi)無(wú)重復(fù)的營(yíng) 養(yǎng)因子 2）每 組 中 應(yīng) 包含只出 現(xiàn) 一次的因子 3）每 組 中其他因子應(yīng) 分 別 出 現(xiàn) 二次如：第八章微生物的遺傳 一 組 ： 1 2 3 4 5 二 組 ： 2 6 7 8 9 三 組 ： 3 7 10 11 12 四 組 ： 4 8 11 13 14 五 組 ： 5 9 12 14 15第八章微生物的遺傳② 組合補(bǔ)充培養(yǎng)基法–將待測(cè)的菌點(diǎn)種到各種補(bǔ)充培養(yǎng)基上，逐個(gè)分析各菌的 缺陷類(lèi)型，或快速分離出所需 缺陷 類(lèi)型的菌株。ABFEDCH G第八章微生物的遺傳缺陷型 的應(yīng)用v作 為 菌株的 遺傳標(biāo)記 ： 進(jìn) 行基因工程、 誘變 育種、v研究代 謝過(guò) 程 時(shí) 用作 親 本 標(biāo)記 ；v作 為 生 產(chǎn) 菌種： aa、核苷酸等生 產(chǎn) 菌種； v作 為 aa、 維 生素、堿基的 測(cè) 定菌株。第八章微生物的遺傳Ames test：對(duì)化學(xué)誘變劑做檢測(cè)菌種：鼠 傷寒沙 門(mén) 氏菌 his ； 原理： his 在基本培養(yǎng)基上不 長(zhǎng) ；而 發(fā)生回復(fù)突 變則長(zhǎng) 。第八章微生物的遺傳Ames test 方法示意圖第八章微生物的遺傳第三節(jié) 基因重組| 定義：凡把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過(guò)遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個(gè)體的方式，稱(chēng)為基因重組（ gene rebination）或遺傳重組。| 作用：重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個(gè)體。| 重組與雜交的關(guān)系：I重組是分子水平上的一個(gè)概念，可以理解成是遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交而一般所說(shuō)的雜交（ hybridization）則是細(xì)胞水平上的一個(gè)概念。I雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交這一形式。I真核微生物中的有性雜交、準(zhǔn)性雜交（ parasexual hybridization）等及原核生物中的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和原I生質(zhì)體融合等都是基因重組在細(xì)胞水平上的反映。第八章微生物的遺傳微生物中各種形式基因重組的比較重組范圍供體和受體的關(guān)系 整套染色體 局部雜合高頻率 低頻率 部分染色體 個(gè)別或少數(shù)基因細(xì)胞融合或聯(lián)結(jié)性細(xì)胞真菌的有性生殖體細(xì)胞真菌的準(zhǔn)性生殖細(xì)胞間暫時(shí)溝通 細(xì)菌的接合 性導(dǎo)細(xì)胞間不接觸吸收游離DNA片段轉(zhuǎn)化噬菌體攜帶DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)由噬菌體提供遺傳物質(zhì)完整噬菌體溶源轉(zhuǎn)變噬菌體 DNA 轉(zhuǎn)染第八章微生物的遺傳基因重組的意義| 基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)。| 雜交育種的優(yōu)點(diǎn)： ① 由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本，因此，不論在方向性還是自覺(jué)性方面，均比誘變育種前進(jìn)了一大步。| ② 利用雜交育種往往還可以消除某一菌株在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，因此，它是一種重要的育種手段。| 雜交育種的缺點(diǎn)： 由于雜交育種的方法較復(fù)雜，工作進(jìn)展較慢，還很難像誘變育種技術(shù)那樣得到普遍的推廣和使用，尤其在原核生物的領(lǐng)域中，應(yīng)用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合等重組技術(shù)來(lái)培育可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐上的高產(chǎn)菌株的例子還不多見(jiàn)。到了 70年代后期，由于原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得巨大的成功后，才使重組育種技術(shù)獲得了飛速的發(fā)展。第八章微生物的遺傳生 長(zhǎng) 快、 產(chǎn) 量低生 長(zhǎng) 慢、 產(chǎn) 量高基因重 組生 長(zhǎng) 快、 產(chǎn) 量高第八章微生物的遺傳一、原核微生物的基因重組| 基因重組的方式z轉(zhuǎn)化z轉(zhuǎn)導(dǎo)z接合z原生質(zhì)體融合第八章微生物的遺傳 R型活菌 +S型死菌 → →S 型活菌216。定義 ： 受體菌自然或在人工技術(shù)作用下直接攝取來(lái)自供體菌的游離 DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移過(guò)程，稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的的受體菌稱(chēng)為 轉(zhuǎn)化子（ transformant）。216。有關(guān)名詞：216。受體菌： recipient/receptor，轉(zhuǎn)化基因的接受者216。供體菌： donor，轉(zhuǎn)化基因的提供者216。轉(zhuǎn)化因子： 來(lái)自供體菌的 DNA片段216。轉(zhuǎn)化子 ： transformant，將轉(zhuǎn)化基因重組進(jìn)入自身染色體組的重組子（一）轉(zhuǎn)化（ transformation）轉(zhuǎn)化及其發(fā)現(xiàn)第八章微生物的遺傳 ① 受體細(xì)胞要處于感受態(tài) .216。感受態(tài) ： petence，受體細(xì)胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)② 供體 DNA片段（ 轉(zhuǎn)化因子 ）大小適宜，分子量一般為1 107 D 左右 ③ 菌株間的親緣關(guān)系密切轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件 轉(zhuǎn)化的類(lèi)型根據(jù)感受態(tài)建立的方式，可以分為：① 自然遺傳轉(zhuǎn)化 natural geic transformation② 人工轉(zhuǎn)化 artificial transformation第八章微生物的遺傳 感受態(tài)| 出現(xiàn)時(shí)間： 只在細(xì)菌生長(zhǎng)的某一時(shí)期出現(xiàn)；不同菌種的感受態(tài)出現(xiàn)在不同生長(zhǎng)時(shí)期z Streptococcus pneumoniae的感受態(tài)出現(xiàn)在生長(zhǎng)曲線中的指數(shù)期的中期，z Bacillus的一些種則往往出現(xiàn)在指數(shù)期末及穩(wěn)定期的初期。z 感受態(tài)由細(xì)胞的遺傳性決定，但同時(shí)也受環(huán)境因子的影響：cAMP、 Ca2+等最明顯。如用 CaCl2 處理 E. coli可以誘發(fā)其產(chǎn)生感受態(tài)。| 感受態(tài)細(xì)胞的比例： 當(dāng)處于感受態(tài)高峰時(shí)，群體中呈感受態(tài)的細(xì)胞因菌種而不同 .z Bacillus subtilis不超過(guò) 10~15%z Streptococcus pneumonia和 Haemophilus influenzae（流感嗜血桿菌）達(dá)到 100%| 轉(zhuǎn)化 DNA的最低濃度： 在群體中含有 15% 感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，?gDNA/ml細(xì)胞懸液即可有效發(fā)生轉(zhuǎn)化第八章微生物的遺傳感受態(tài)因子： 細(xì)胞外蛋白， Streptococcus pneumonia和 Bacillus中分離的分子量為5,000~10,000Dalton，可能存在于細(xì)胞膜上，可催化外來(lái) DNA分子的吸收或降解細(xì)胞表面某種成分，以讓細(xì)胞表面的 DNA受體顯露出來(lái)；也可能是一種自溶酶。對(duì)不同細(xì)菌，每個(gè)細(xì)胞上的 DNA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)不同。有人計(jì)算，在 H. Influenzae上有 4~10個(gè)，而在 S. Pneumonia上則有 30~80個(gè)。 S. Pneumonia的感受態(tài)細(xì)胞中提取的感受態(tài)因子可使同菌株的非感受態(tài)細(xì)胞變成感受態(tài)的，而 Bacillus subtilis的感受態(tài)因子則無(wú)此功能。第八章微生物的遺傳轉(zhuǎn)化因子| 轉(zhuǎn)化因子：本質(zhì)是供體 DNA片段z 一般的轉(zhuǎn)化因子都是線狀雙鏈 DNA；也有少數(shù)報(bào)道認(rèn)為線狀單鏈 DNA也有轉(zhuǎn)化作用。z 大?。航?jīng)過(guò)多次提純操作后，每一轉(zhuǎn)化 DNA片段的分子量都小于 1107，即約占細(xì)菌核染色體組的 % ，其上平均約含 15個(gè)基因。而粗制的 DNA則分子量較大。z 吸收數(shù)量：每個(gè)感受態(tài)細(xì)胞約可摻入 10個(gè)轉(zhuǎn)化因子。z 轉(zhuǎn)化頻率： 一般只有 ~1% ，最高時(shí)亦達(dá) 10% 左右。據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式 （雙 鏈閉 合 環(huán) 狀） 的轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高（因?yàn)樗M(jìn)入受體菌中后，可不必與受體染色體進(jìn)行交換、整合即可進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)）。第八章微生物的遺傳轉(zhuǎn)化的過(guò)程以 S. Pneumonia strr（肺炎鏈球菌抗鏈霉素菌株）為例，大致可分為六階段：吸附： 雙鏈 DNA片段與細(xì)胞表面的特定位點(diǎn)（主要在新形成細(xì)胞壁的赤道區(qū)）結(jié)合，此時(shí)，細(xì)胞膜上的膽堿可促進(jìn)這一過(guò)程。在吸附過(guò)程的前階段，如外界加入 DNA酶，就會(huì)減少轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生。稍后， DNA酶即無(wú)影響，說(shuō)明此時(shí)該轉(zhuǎn)化因子已進(jìn)入細(xì)胞；切割： 在吸附位點(diǎn)上的 DNA被核酸內(nèi)切酶分解，形成平均分子量為4~5106的 DNA片段；入胞： DNA雙鏈中的一條單鏈被膜上的另一種核酸酶切除，另一條單鏈逐步進(jìn)入細(xì)胞，這是一個(gè)耗能的過(guò)程。分子量小于 5105的DNA片段不能進(jìn)入細(xì)胞。這時(shí)如用低濃度溶菌酶處理，因它提高了細(xì)胞壁的通透性，故可提高轉(zhuǎn)化頻率；重組： 來(lái)自供體菌的單鏈 DNA片段在細(xì)胞內(nèi)與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)配對(duì)，接著受體染色體組上的相應(yīng)單鏈片段被切除，并被外來(lái)的單鏈 DNA交換、整合和取代，于是形成了一個(gè)雜合 DNA區(qū)段（ heterozygous region）。在這一過(guò)程中，有核酸酶、 DNA聚合酶和 DNA連接酶的參與；復(fù)制 ：受體菌的染色體組進(jìn)行復(fù)制，雜合區(qū)段分離成兩個(gè)，其中之一獲得了供體菌的轉(zhuǎn)化基因，另一個(gè)未獲供體基因；轉(zhuǎn)化子形成： 當(dāng)細(xì)胞發(fā)生分裂后，一個(gè)子細(xì)胞含供體基因，這就是轉(zhuǎn)化子；另一個(gè)細(xì)胞與原始受體菌一樣。第八章微生物的遺傳降解吸附切割成 4~5106單鏈入胞同源部分配對(duì)、整合復(fù)制分裂，只有一個(gè)子代DNA分子獲得供體基因非轉(zhuǎn)化子 轉(zhuǎn)化子第八章微生物的遺傳轉(zhuǎn)化的過(guò)程strrstrr第八章微生物的遺傳自然轉(zhuǎn)化的普遍性 到目前為止，已發(fā)現(xiàn)能發(fā)生轉(zhuǎn)化作用的菌屬主要有：4 Streptococcus pneumoniae、 Haemophilus（嗜血桿菌屬）、 Bacillus、 Neisseria（奈瑟氏球菌屬）、 Rhizobium（根瘤菌屬）、 Staphylococcus、 Pseudomonas和Xanthomonas中多見(jiàn)。4 在若干放線菌和藍(lán)細(xì)菌以及 Saccharomyces cerevisiae、 Neurospora crassa（粗糙脈胞菌）和 Aspergillus niger中，也有轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。4 腸桿菌科的一些細(xì)菌很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，主要原因一方面由于外來(lái) DNA難以摻入到細(xì)胞中，另一方面在受體細(xì)胞內(nèi)常存在可降解線形 DNA的核酸酶。如果用 CaCl2處理 E. coli的球狀體，就可以使之發(fā)生低頻率的轉(zhuǎn)化。另外，可利用霉菌的原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。4 兩個(gè)菌種或菌株之間能否發(fā)生轉(zhuǎn)化，與它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中的親緣關(guān)系有著密切的關(guān)系。但即使在轉(zhuǎn)化率極高的菌種中，其不同菌株間也不一定都能發(fā)生轉(zhuǎn)化。第八章微生物的遺傳人工轉(zhuǎn)化 人工轉(zhuǎn)化 —— 是通過(guò)人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取 DNA的能力，或人工地將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 方法：① CaCl2處理細(xì)胞，使其成為能攝取外源 DNA的感受態(tài)狀態(tài) .② 電穿孔法 electroporation：用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜，或擊成小孔，使各種大分子（包括 DNA ）能通過(guò)這些小孔進(jìn)入細(xì)胞。第八章微生物的遺傳可轉(zhuǎn)化的形狀莢膜多糖的合成專(zhuān)一性酶的合成專(zhuān)一性蛋白質(zhì)的合成抗藥性第八章微生物的遺傳 （ transfection）| 定義：z 把噬菌體或其它病毒的 DNA（或 RNA）抽提出來(lái)，讓它去感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并進(jìn)而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒的后代，這種現(xiàn)象稱(chēng)為轉(zhuǎn)染（ transfection）。| 與轉(zhuǎn)化的區(qū)別：z 病毒或噬菌體并非遺傳基因的供體菌z 中間不發(fā)生任何遺傳因子的交換或整合z 最后不產(chǎn)生具有雜種性質(zhì)的轉(zhuǎn)化子第八章微生物的遺傳[173。][173。][173。]Try173。his+ Try+his173。Try+his+混合培養(yǎng)A B三、轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction）（ 1952）在 Salmonella typhimurium（鼠傷寒沙門(mén)氏菌）中發(fā)現(xiàn)的。 第八章微生物的遺傳A B[173。] [173。]Try+his+Try173。hi