【正文】 方法 色譜定量方法有很多 ， 常用的有 歸一化法 、 外標(biāo)法 、 內(nèi)標(biāo)法 、 內(nèi)加法 、 轉(zhuǎn)化法 等 。 需根據(jù)不同的要求選擇合適的定量方法 。 尤其是歸一化法 ， 特別適用于初學(xué)者 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 117 歸一化法 normalization method %1 0 0. . . .. . . .%1 0 0nn2211iiii ???????? fAfAfAfAfAmmwii要求 ： 試樣中所有組分都能出分峰 (出柱并有響應(yīng) )。 原理 ： 試樣中所有組分 (含溶劑 )含量之和為 100%，組分 i 在試樣中的質(zhì)量分?jǐn)?shù) wi按下式計(jì)算： 特點(diǎn) ：簡(jiǎn)單 、 準(zhǔn)確 、 對(duì)進(jìn)樣量的要求不高 。 但當(dāng)試樣中有組分無峰時(shí)不能使用 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 118 外標(biāo)法 external standard method 即其它分析方法中描述的標(biāo)準(zhǔn)曲線法 。 過程 ： 用標(biāo)準(zhǔn)物配制系列標(biāo)準(zhǔn)液 ， 在選定色譜條件下進(jìn)樣分離 ， 用峰面積對(duì)濃度做 標(biāo)準(zhǔn)曲線 。 以同樣方法測(cè)定分析試樣 ， 由所得峰面積從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測(cè)組分的含量 。 特點(diǎn) ： 操作簡(jiǎn)單 ， 適合大批量試樣的分析 。 但是 ，進(jìn)樣量 等實(shí)驗(yàn)條件對(duì)測(cè)定的準(zhǔn)確度有很大的影響 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 119 內(nèi)標(biāo)法 internal standard method 適用 ：因各種原因不能使所有組分都出峰 ， 或有組分含量過大 (小 )， 或只要分析樣品中少量組分時(shí) 過程 ：在總量 m的樣品中加入質(zhì)量為 mS的內(nèi)標(biāo)物 S，然后根據(jù)被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的重量和在色譜圖上相應(yīng)的峰面積比求出某組分 i 的含量 。 方法 ：選擇一種試樣中不存在的物質(zhì)作為 內(nèi)標(biāo)物 ，將一定量的內(nèi)標(biāo)物 加入 到準(zhǔn)確稱量的試樣之中 ， 混勻后取一定體積進(jìn)樣分離 ， 根據(jù)待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比 ， 求出待測(cè)組分的含量 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 120 %1 0 0%1 0 0 sssiiii ????? mmAfAfmmwSUM：通過外加的內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)物的峰面積 、 校正因子之間的比例關(guān)系 ， 由內(nèi)標(biāo)物的量來確定待測(cè)物的量 。 i i i i iiss s s s sm f A f Ammm f A f A? ? ?2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 121 優(yōu)點(diǎn) ： 不受試樣中的各組分是否都出峰的限制 ，但卻可以消除由于進(jìn)樣量和其它實(shí)驗(yàn)條件的波動(dòng)對(duì)定量的影響 。 缺點(diǎn)： 每一個(gè)試樣均需加入一定量的內(nèi)標(biāo)物 ， 增加了測(cè)定的工作量 。 內(nèi)標(biāo)物 選取要求 ，最好在樣品中不存在，其保留值在所有組分保留值的中間，加入內(nèi)標(biāo)物的含量和待測(cè)組分含量不應(yīng)相差很大。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 122 儀器及氣相色譜法特點(diǎn) 氣相色譜儀 由載氣系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)和記錄系統(tǒng)等部分所組成。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 123 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 124 1) 載氣系統(tǒng) 其作用是向色譜儀的分離 、 檢測(cè)系統(tǒng)提供純度高 、流速穩(wěn)定的氣體流動(dòng)相 。 載氣系統(tǒng)由氣源 （ 一般為N H2鋼瓶 ） 、 氣體凈化器 、 載氣流量調(diào)節(jié)閥和流量表所組成 。 注意 ：因?yàn)闅庀嗌V的分離作用主要依靠固定相對(duì)組分的選擇性作用，流動(dòng)相 (載氣 ) 對(duì)被分離的組分主要起運(yùn)載作用，對(duì)分離的選擇性作用不明顯。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 125 2) 進(jìn)樣系統(tǒng) 由進(jìn)樣口 、 氣化室和微量注射器組成 進(jìn)樣程序： a)吸取試樣溶液 b)刺穿硅橡膠隔膜 c)樣品進(jìn)入汽化室 d)試樣迅速汽化 e)被載氣攜帶入柱 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 126 3) 分離 系統(tǒng) 分離由色譜柱完成 。 氣相色譜柱分填充柱和毛細(xì)管柱兩類 。 氣相色譜往往需要在高于室溫的溫度下進(jìn)行分離 ，故色譜柱需放置一可控溫的恒溫箱中 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 127 填充柱和毛細(xì)管柱比較 參 數(shù) 毛細(xì)管柱 填 充 柱 柱長(zhǎng)（ m） 內(nèi)徑（ mm） 填充物粒度 總柱效 (板數(shù) ) 柱前壓 (Mpa) 樣品量 (μl) 分析對(duì)象 20—100 — 2μm或無 幾萬到幾十萬 — 小于 復(fù)雜組份分析 1— 5 2— 4 80—100目 1500—8000 大于 簡(jiǎn)單樣品分析 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 128 氣液色譜 為分配型色譜機(jī)理 ， 固定相由一些高沸點(diǎn)有機(jī)化合物 (固定液 )涂漬在多孔的擔(dān)體 (最常用的擔(dān)體是硅藻土擔(dān)體 )之上所形成的液體固定相 。目前已有至少 2022種色譜固定液 。 氣固色譜 為吸附色譜機(jī)理 ， 固定相為一些固體吸附劑 （ 如 Al2O 硅膠 、 分子篩等 ） 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 129 4) 檢測(cè) 系統(tǒng) 作用 ： 將經(jīng)色譜柱分離并在載氣攜帶下從色譜柱后依此流出之各組分的濃度轉(zhuǎn)換成易檢測(cè)的電信號(hào)并記錄為色譜圖 。 種類 ：根據(jù)檢測(cè)性能而分類 。 最常用的有： 熱導(dǎo)池檢測(cè)器 (TCD)——根據(jù)待測(cè)組分和載氣導(dǎo)熱能力的差異而設(shè)計(jì) ， 屬通用型檢測(cè)器 。 氫火焰離子化檢測(cè)器 (FID)——根據(jù)有機(jī)化合物在氫火焰中燃燒時(shí)能產(chǎn)生少量離子而設(shè)計(jì) 。 靈敏度較 TCD高 ， 但只能響應(yīng)有機(jī)化合物 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 130 5) 記錄 系統(tǒng) 所有結(jié)果將用記錄系統(tǒng)給予記錄 。 最簡(jiǎn)單的配置是使用記錄儀 ， 而后測(cè)量峰寬峰高并手工計(jì)算峰面積等參數(shù) 。 現(xiàn)均配置色譜處理機(jī)或色譜工作站 ， 自動(dòng)擔(dān)負(fù)色譜圖的記錄和保留值 、 峰高 、 峰面積 (乃至塔板數(shù)和分離度 )的計(jì)算 ， 并能直接報(bào)告分析結(jié)果 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 131 氣相色譜法的特點(diǎn)和應(yīng)用 1) 分離效率高 。 一般一根 1～ 2 m的色譜柱 ， 理論塔板數(shù)可達(dá)數(shù)千 ， 毛細(xì)管柱可達(dá)數(shù)萬 。 2) 分析速度快 。 最快時(shí)可在 30min內(nèi)完成 200~300個(gè)組分的定性定量分析 。 3) 靈敏度高 。 氣相色譜可檢測(cè)出 1011～ 1012g的物質(zhì) ，可以直接用以測(cè)定試樣 (如環(huán)境檢測(cè)中的水和大氣 )中的微 (痕 )量物質(zhì) 。 4) 價(jià)廉 。 設(shè)備不太復(fù)雜 ， 操作費(fèi)用比較低 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 132 氣相色譜主要用于分析分子量較小 （ 400） 的低沸點(diǎn) （ 500?C） 化合物 ， 如煉油廠的低沸點(diǎn)油類 、 化學(xué)品中的痕量雜質(zhì) 、 環(huán)境中的有機(jī)污染物 、 飲料中的成分 、 食品中的農(nóng)藥殘留 、 化妝品中的香料等等 ，被廣泛地應(yīng)用于石油 、 化工 、 環(huán)保 、 輕工 、 醫(yī)藥衛(wèi)生 、 食品飲料等行業(yè) 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 133 HPLC法的特點(diǎn)及儀器 液相色譜 —— 采用不同配比的液體為流動(dòng)相。 早先：常壓自流系統(tǒng)的柱色譜 現(xiàn)代：采用高壓液體 (可達(dá)到 40MPa)為流動(dòng)相 采用極細(xì)固定相 (5~10μm)，故柱效高 (N可達(dá)數(shù)萬 )，又稱為高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography， HPLC)。 當(dāng)初也有稱高壓色譜 (high pressure LC)的。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 134 HPLC分離模式 有液液分配色譜、液固吸附色譜、離子交換色譜、空間排阻色譜 (基于分子體積大小而分離 )、親和色譜等。 不同的分離模式的 異同 ：主要是固定相和流動(dòng)相有所不同，儀器及操作方法大同小異。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 135 HPLC特點(diǎn) 1) 高效 ：理論塔板數(shù)一般可達(dá) 104左右。 2) 高速 ：分離分析一個(gè)試樣中的幾個(gè)組分一般只要幾到幾十分鐘。 3) 高靈敏度 ：常用的紫外檢測(cè)器 (VWD或 DAD) 最低檢測(cè)量為 107～ 1012 g。用熒光檢測(cè)器更佳。 4) 適用面廣 ：有多種分離模式可供選擇且不受組分是否易揮發(fā)的限制，其適用面廣。廣泛應(yīng)用于化工、制藥、醫(yī)院、衛(wèi)生、生物、食品、輕工等行業(yè)。化學(xué)品、合成藥物和天然化合物、高聚物、生物大分子、無機(jī)離子、金屬有機(jī)化合物等均可。 5) 價(jià)高 ：儀器設(shè)備相對(duì)較貴，操作費(fèi)用較高。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 136 HPLC儀器 高效液相色譜儀一般由儲(chǔ)液器、高壓泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)和記錄系統(tǒng)等部分組成。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 137 (1) HPLC流動(dòng)相 色譜流動(dòng)相決不僅僅是被分離物質(zhì)的運(yùn)載體，它直接影響到分離的好壞，影響到測(cè)定的成功與否。 與 GC不同， HPLC的流動(dòng)相對(duì)組分具有很強(qiáng)的選擇性，可以根據(jù)具體的分析任務(wù)選擇極性、酸度、離子強(qiáng)度各異的溶劑與一定的固定相配合，形成最佳的分離體系。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 138 為保持色譜柱的穩(wěn)定性，要求： 1) 與固定相不互溶 （延長(zhǎng)柱壽命） 2) 不發(fā)生不可逆吸附 3) 有合適的 pH值 4) 化學(xué)惰性 ——不與樣品及固定相發(fā)生反應(yīng)。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 139 (2) 流動(dòng)相供應(yīng)和驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 由儲(chǔ)液器和高壓泵組成 。 因所填固定相極細(xì) ， 滲透性變 差 ， 需高壓流動(dòng)相方可通過色譜柱 。 目前高效液相色譜儀上用的高壓泵大多是機(jī)械式往復(fù)柱塞泵 ， 可以產(chǎn)生幾百個(gè)大氣壓的壓力 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 140 往復(fù)柱塞泵 有明顯脈沖，需采取措施：增加脈沖阻尼器、改變凸輪形狀、加電子線路保護(hù)、用多頭泵系統(tǒng)(并聯(lián)串聯(lián) )等。 目前應(yīng)用較多。偏心輪帶動(dòng)活塞往復(fù)移動(dòng)，恒流輸出，并通過改變電機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)流量。體積小清洗方便，特別適用于梯度淋洗。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 141 梯度洗脫裝置 配比固定的流動(dòng)相可采用單泵驅(qū)動(dòng) ， 配比需不斷改變的可選用梯度泵 。 可按需要預(yù)設(shè)程序 ， 目前最多可使 4種溶劑以任意比例相混合 ， 自動(dòng)得到洗脫強(qiáng)度隨時(shí)間變化的流動(dòng)相 ， 以提高柱效和分離速度 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 142 輔助裝置 1) 過濾器：除掉機(jī)械雜質(zhì)及固體顆粒。 2) 混合器：體積不宜大，靠流經(jīng)泵的動(dòng)力學(xué)特性而混合。 3) 脈動(dòng)阻尼器：種類多，都有一定容積和彈性 4) 壓力測(cè)量裝置： 5) 流量測(cè)量裝置： 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 143 (3) 進(jìn)樣系統(tǒng) 因 HPLC柱壓高 ， 不能直接用注射器山南樣 。 需進(jìn)樣閥進(jìn)樣 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 144 取樣狀態(tài) ：流動(dòng)相直接進(jìn)柱，進(jìn)樣口與定量管連接，樣品充滿定量管后，多余樣品從 6流出。 進(jìn)樣狀態(tài) ：泵將流動(dòng)相壓入定量管，將樣品全部攜帶進(jìn)入色譜柱分析。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 145 (4) 分離系統(tǒng) 色譜柱：內(nèi)徑 ～ mm、 長(zhǎng)度 15～ 30 cm的直型不銹鋼管 ， 內(nèi)充極細(xì) (粒徑 5~10?m)的固定相 。用 18個(gè)碳的烷烴改性的 C18硅膠是最常用的固定相 。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 146 HPLC柱及附件 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 147 （ 5）檢測(cè)記錄系統(tǒng) 常用有折光檢測(cè)器 (RID)和紫外吸收檢測(cè)器 (VWD)。 RID——通用型 檢測(cè)器，測(cè)定流動(dòng)相折光率的變化； VWD——專用型 檢測(cè)器，適用于有紫外吸收的化合物的檢測(cè)。有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器 (DAD)。 其他如熒光檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器 (多用于離子色譜 )。 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 148 二極管陣列檢測(cè)器光路圖 2022/10/24 無機(jī)與分析化學(xué) 第十章 149 安捷倫HP一一OO系列的高效液相色譜儀