【正文】 化氰法等 。 ? 雙功能或多功能試劑 使酶與酶之間交聯(lián)的固定化方法。 ? 此法與共價(jià)結(jié)合法一樣也是利用共價(jià)鍵固定酶的， 不同的是它不使用載體 。做為交聯(lián)劑的有形成希夫堿的戊二醛、形成肽鍵的異氰酸酯、發(fā)生重氮偶合反應(yīng)的雙重氮聯(lián)苯胺等。 ? 特點(diǎn)： 應(yīng)用條件較激烈、酶活回收率低。 分網(wǎng)格型和微囊型 ? 網(wǎng)格型：埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的方法 。 ? 微囊型：包埋在高分子半透膜中的方法 。 ? 特點(diǎn)：包埋法一般很少改變酶的高級結(jié)構(gòu) ， 酶活回收率較高 ， 因此可用于許多酶的固定化 ，但必須巧妙地設(shè)計(jì)反應(yīng)條件 。 ? 適合范圍 ：小 分子底物和產(chǎn)物的酶 ， 因?yàn)橹挥行》肿硬趴梢酝ㄟ^高分子凝膠的網(wǎng)格進(jìn)行擴(kuò)散 。 固定化酶的模式 (5)疏水作用； （ 6）脂質(zhì)體包埋； （ 7）微膠囊 固定化酶催化的動(dòng)力學(xué)特征 ? 酶固定化后性質(zhì)的變化 ? 評價(jià)固定化酶指標(biāo)：酶活力表現(xiàn)率和酶活力收率 ? 影響固定化酶動(dòng)力學(xué)的因素 ? 固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 固定化酶催化的動(dòng)力學(xué)特征 ? 酶固定化后性質(zhì)的變化 ： ① 底物專一性的改變： ② pH的改變 ③ 穩(wěn)定性 —— 熱的穩(wěn)定性 、 貯藏穩(wěn)定性 、 操作穩(wěn)定性 ④ 動(dòng)力學(xué)的改變 。 ? 原因： ① 酶自身的變化 —— 主要由于活性中心氨基酸殘基 、 空間結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)變化； ② 載體的物理和化學(xué)性質(zhì)的變化 。 大多數(shù)酶在固定化后，其 Km值增加，表示 催化反應(yīng)活性將下降。也有少數(shù)酶固定化后活性無變化，甚至有所增大。 評價(jià)這種活性變化可用下述兩種指標(biāo)來衡量：酶活力表現(xiàn)率和酶活力收率。 ? 酶活力表現(xiàn)率 （ 相對活力 ） ： 實(shí)際測定的固定化酶的總活力與被固定化了的酶在溶液狀態(tài)時(shí)的總活力之比 。 ? 酶活力收率 （活力回收）： 實(shí)際測定的固定化酶的總活力與固定化時(shí)所用的全部游離酶的活力之比。 上述兩種指標(biāo)之差別在于是否考慮了所剩余的未被固定化的酶。 影響固定化酶動(dòng)力學(xué)的因素 ? 分子構(gòu)象的改變 ? 位阻效應(yīng) ? 微擾效應(yīng) ? 分配效應(yīng) ? 擴(kuò)散效應(yīng) 固定化酶反應(yīng)歷程 ① 底物從液相主體傳向固定化酶周圍的滯流液層（外表面）； ②底物擴(kuò)散通過這一滯流液層到載體外表面； ③進(jìn)行酶促反應(yīng)； ④底物由載體外表面向載體內(nèi)擴(kuò)散； ⑤產(chǎn)物由內(nèi)部擴(kuò)散到載體外表面； ⑥產(chǎn)物由載體外表面到滯流液層； ⑦產(chǎn)物由滯流液層傳遞到主體溶液 ? 當(dāng)酶固定化于載體的外表面時(shí)，沒有④ 和⑤兩個(gè)階段。 ? ①和② 、⑥和⑦是屬于外擴(kuò)散過程， ④、 ⑤則為內(nèi)擴(kuò) 散過程。 ? 可以看出，固定化酶的催化反應(yīng)受到了物質(zhì)傳遞和酶促反應(yīng)兩個(gè)方面的影響。 固定化酶反應(yīng)歷程 影響固定化酶動(dòng)力學(xué)的因素 （ 1）分子構(gòu)象的改變 ：指固定化過程中酶和載體的相互作用引起酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心的構(gòu)象發(fā)生了變化，導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合活力下降的一種效應(yīng)。 ? 特點(diǎn)：難以定量描述與預(yù)測。 多出現(xiàn)于吸附法和共價(jià)偶聯(lián)法的固定化酶中 。 （ 2）位阻效應(yīng) ： 載體的遮蔽作用 (如載體的空隙太小，或者固定化位置或方法不當(dāng)，給酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心造成空間障礙，使底物和效應(yīng)物無法與酶接觸等 )引起的。 ? 特點(diǎn)： 選擇適宜的載體與固定化方法，可消除這種不利因素的影響，但這種效應(yīng)難以定量描述 與預(yù)測。 （ 3）微擾效應(yīng) ? 由于載體的親水性、疏水性及介質(zhì)的介電常數(shù)等，使緊鄰固定化酶的環(huán)境區(qū)域 (微環(huán)境 )發(fā)生變化，改變了酶的催化能力及酶對效應(yīng)物做出調(diào)節(jié)反應(yīng)的能力。 ? 特點(diǎn)：這種效應(yīng)難以定量描述和預(yù)見 ， 但可以通過改變載體與介質(zhì)的性質(zhì)而做出判斷與調(diào)節(jié) 。 空間效應(yīng)模擬圖 （ 4）分配效應(yīng) ? 分配效應(yīng)是由于固定化載體與底物或效應(yīng)物之間的疏水性，親水性及靜電作用所引起微環(huán)境 (固定化酶緊鄰的微觀局部環(huán)境 )和宏觀環(huán)境之間物質(zhì)的不等分配，改變了酶反應(yīng)系統(tǒng)的組成平衡，從而影響酶反應(yīng)速率的一種效應(yīng)。 （ 4）分配效應(yīng) ? 分配效應(yīng)可以通過分配系數(shù) Kp來定量描述 。 ? Kp的定義是載體內(nèi)外底物 (或其他物質(zhì) )濃度之比 。 ? 測定 Kp方法：在已知濃度和體積的底物溶液中 ， 放人不含底物的一定體積的載體 ， 并保持適宜條件 ， 當(dāng)達(dá)到平衡時(shí) ， 測定載體外溶液中的底物濃度 。 （ 5）擴(kuò)散限制 ? 指底物、產(chǎn)物及其他效應(yīng)物的遷移和傳遞速度所受到的一種限制。 ? 物質(zhì)的傳遞過程包括分子擴(kuò)散和對流擴(kuò)散。這種擴(kuò)散過程的速率在某些情況下可能會對反應(yīng)速率產(chǎn)生限制作用。 ? 擴(kuò)散限制效應(yīng)可分為外擴(kuò)散限制效應(yīng)和內(nèi)擴(kuò)散限制效應(yīng)。 分配效應(yīng)與擴(kuò)散效應(yīng) 分配效應(yīng) 擴(kuò)散效應(yīng) 分配和擴(kuò)散效應(yīng)同時(shí)作用 固定化酶剖面圖及濃度分布圖 固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué) ? 本征動(dòng)力學(xué) 指酶的真實(shí)動(dòng)力學(xué)行為 ， 包括溶液酶和固定化酶在內(nèi) 。 對后者 ， 它僅將空間效應(yīng)的影響考慮在內(nèi) 。 從這個(gè)意義上講 ， 固定化酶的本征動(dòng)力學(xué)與溶液酶的本征動(dòng)力學(xué)是有差別的 。 ? 固有動(dòng)力學(xué) 在本征動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)上，僅僅考慮由于這種分配效應(yīng)而造成的濃度差異對動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生的影響，所建立的動(dòng)力學(xué)稱為固有動(dòng)力學(xué) ? 表觀動(dòng)力學(xué) 表觀動(dòng)力學(xué) ? 不論分配效應(yīng)是否存在，固定化酶受到擴(kuò)散限制時(shí)所觀察到的速率稱為有效反應(yīng)速率，或稱為宏觀反應(yīng)速率。 ? 據(jù)此所建立的動(dòng)力學(xué)方程稱為宏觀動(dòng)力學(xué)方程 ， 或稱為有效動(dòng)力學(xué)方程 。 ? 所建立的宏觀動(dòng)力學(xué)方程也不完全服從M— M方程形式 。 固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 外擴(kuò)散限制效應(yīng) ? 特征： ① 底物：液相主體 固定化酶外表面 固定化酶外表面反應(yīng) ② 產(chǎn)物：固定化酶外表面 液相主體 ? 外擴(kuò)散是先于反應(yīng)發(fā)生，與反應(yīng)過程是串聯(lián)進(jìn)行的。 ? 假定對一非帶電的固定化酶 ， 其外表面上的反應(yīng)速率符合 M— M方程形式 ， 即 底物由液相主體擴(kuò)散到固定化酶外表面的速率應(yīng)表示為 NS=kLα([S][S]S) kLα—— 體積氧傳遞系數(shù) （ 1/S） ? 定態(tài)條件下 ， 應(yīng)存在 Rs＝ Ns， 即該式表示了在定態(tài)條件下 ， 外擴(kuò)散傳質(zhì)速率等于在固定化酶外表面上底物的反應(yīng)速率 。 SmSm a xS]S[K]S[rR??B分析： ① 若 Rs＜＜ Ns ， 即外表面反應(yīng)是控速步驟 ， 則 最大反應(yīng)速率； ② 若 Rs＞＞ Ns ， 即外擴(kuò)散是控速步驟 ， 則 r= Ns= kLα [S]= N0 0s0m0m a xS R]S[K]S[rRr ????C求解 —— 圖解 ① [S]0較低 ， RS0＞ N0， 外擴(kuò)散是控速步驟； ② [S]0較高 ， RS0＜ N0， 外 表 面 反 應(yīng) 是 控 速 步驟； ③ [S]0處于中間； RS0、N0相差不大 ， 則有 RS = N0 通過 Dα計(jì)算求解 。 RS=NS， C*=[S] S/[S], K=Km/[S] 1 C*= Da C*/（ K + C* ） α ＜ 0 α ＞ 0 + α = Da +K1， [S] S= C* [S] SmSm a xS]S[K]S[rR??NS=kLα（ [S][S]S） [ S ]m a xakrDL?????????????? 1412 2**?? KC Dα—— 重要無因次數(shù)群 ? 定義： ? 物理意義可表示為 ： 1. 當(dāng) Da ＜＜ 1時(shí)，酶催化最大反應(yīng)速率要大大慢于底物的擴(kuò)散速率。此時(shí)該反應(yīng)過程為反應(yīng)動(dòng)力學(xué)控制。接近本征動(dòng)力學(xué)； Da ＞＞ 1時(shí)，則底物最大擴(kuò)散速率要大大慢于酶催化底物的反應(yīng)速率，此時(shí)該反應(yīng)過程為傳質(zhì)擴(kuò)散控控制。接近擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)。 ? 應(yīng)用： ，即 Da ＜＜ 1 減小顆粒直徑，改變流速，底物濃度增加。 2. 圖解 最大傳質(zhì)速率最大反應(yīng)速率??D[ S ]m a xakrDL?? 2. 圖解 ? 底物在固定化酶外表面處的濃度應(yīng)同時(shí)滿足傳質(zhì)速率方程式和反應(yīng)速率方程式，因此可通過作圖法求出 [S]值和相應(yīng)的速率值。 例：某酶固定于無微孔的球形載體上，在排除外擴(kuò)散影響的條件下測得其動(dòng)力學(xué)參數(shù)為rmax=4 105mol/(L s)， Km=2 105mol/L，現(xiàn)將固定化酶顆粒裝入底物濃度為 1 105mol/L的反應(yīng)器中，并已知在這一操作條件下的流體傳質(zhì)系數(shù)為 4 101(1/S)，求：底物在固定化酶的外表面的反應(yīng)速率。 10101104 104 5150m ax ??????????SLa CkrDa2101102][ 550* ???????SKK m 解： 1112101* ??????? KDa?111241211141222**?????????????????????????? KC[S] S= C* [S]= 1 105 = 106 mol/L 反應(yīng)速率 s)m o l / ( ][][56565m ax?????????????????SmSSSKSrR（外擴(kuò)散） 0o u trro u t ??? 率化酶外表面處的反應(yīng)速無外擴(kuò)散影響時(shí)的固定反應(yīng)速率有外擴(kuò)散影響時(shí)的實(shí)際m a xo u t0o u to u t rrr ????)()1(][**m ax][m a x??? DcKKcrSK SmSr So u t?????? ： 內(nèi)擴(kuò)散于反應(yīng)同時(shí)發(fā)生 ， 與反應(yīng)過程是并聯(lián)進(jìn)行的 。 ： 假設(shè)： ① IE內(nèi)任意一處均會發(fā)生反應(yīng) ， 并且反應(yīng)服從MM方程； ② IE基質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)傳遞按分子擴(kuò)散的方式進(jìn)行； ③ IE的外表處 ， 無傳遞阻力存在 ， 即 K=1； ④ IE顆粒是圓形的； ⑤ 擴(kuò)散效應(yīng)用 Fick定理描述 Ns=De{d[S]/dz}。 ⑥ 產(chǎn)物與底物的濃度僅沿半徑 r方向變化 。 A數(shù)學(xué)模型： 根據(jù)以上假設(shè)建立方程： 對底物進(jìn)行物料恒算 即 流入量 流出量 =反應(yīng)量 建立方程 φ西勒準(zhǔn)數(shù) ? 定義： ? 物理意義： 是表面反應(yīng)速率 (即以固定化酶外表面處的濃度為基準(zhǔn)反應(yīng)速率）與內(nèi)擴(kuò)散速率之比。 ? 應(yīng)用：求內(nèi)效率因子 [例 ]分析下圖 ηin與 φ和 β關(guān)系 ? φ ≤，不隨 φ變化，近似等于 1，也就是沒有內(nèi)部傳質(zhì)阻力。 ? 若 φ ≥ ，則有 ηin 1，反應(yīng)為 內(nèi)傳質(zhì)所限制。 ηin ? ηin是 φ與 β的函數(shù)