【正文】 取白膜層，用10ml預(yù)冷的培養(yǎng)基洗2次。計數(shù)分離得到的淋巴細胞，最后將細胞重懸于20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。 免疫小鼠IFNγ的ELISPOT檢測 ELISPOT檢測具體操作按Murine IFNγ ELISPOT 試劑盒產(chǎn)品說明書進行，主要步驟如下：（1）在用100μl/孔70%乙醇清洗ELISPOT板，室溫下放置10min；（2）棄去乙醇，100μl/孔PBS洗板3次；（3）用10ml PBS稀釋100μl捕獲抗體（capture antibody），混勻，加入PVDF板中，100μl/孔，4℃靜置過夜（16h）；（4）次日清空孔內(nèi)液體，100μl/孔PBS洗板1次，加入100μl/孔2%脫脂奶PBS，室溫封閉2h；（5）輕輕晃動ELISPOT板，棄去孔內(nèi)液體，在紙上輕輕拍干，100μl/孔PBS清洗1次；（6）在每孔中加入合適濃度的細胞懸液和刺激原混合液共100μl，蓋好板蓋，于37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)20h；（7）輕輕晃動ELISPOT板，清空孔內(nèi)液體，在紙上輕輕拍干；（8）加入100μl/孔洗液（%Tween20的PBS），4℃靜置10min；（9）100μl %Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次，每次靜置1min；（10）用10ml 1% BSA 的PBS稀釋100μl檢測抗體（detection antibody），混勻，每孔加入100μl，37℃ ；（11）清空孔內(nèi)液體，100μl %Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次；（12）用1%BSA PBS稀釋鏈親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶（StreptavidinAlkaline Phosphatase Conjugate），每孔加入1:5000的稀釋酶液100μl，37℃孵育1h；（13）清空孔內(nèi)液體，100μl %Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次，拍干ELISPOT板直至沒有殘留液體；（14）在每孔中加入100μl即用型BCIP/NBT底物反應(yīng)液。室溫避光顯色2～10min，肉眼觀察斑點的形成；待斑點形成后，用蒸餾水終止反應(yīng)；（15）拍干ELISPOT板，4℃放置過夜，ELISPOT儀讀取結(jié)果（ImmunoSpot Beta 1軟件），室溫避光保存。轉(zhuǎn)貼于 中國論文下載中心 2 結(jié)果 原核表達載體pBVIL1/T、pBVIL1/Tat+T的構(gòu)建與鑒定 將Tat、多表位（T）基因克隆于原核表達載體pET22b,構(gòu)建原核表達載體PET/Tat、PET/T,用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切PET/Tat和T基因，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，連接Tat和多表位基因。 將含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因克隆入原核表達載體pBVIL1，原核表達載體的構(gòu)建過程見圖1。酶切鑒定pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T的陽性克隆，經(jīng)測序與設(shè)計序列完全一致，成功構(gòu)建的原核表達載體可進行表達純化。 目的蛋白的誘導(dǎo)表達與純化 將測序正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng) 15% SDSPAGE電泳pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T分別在分子量22103和21103處出現(xiàn)一新增的蛋白條帶，其大小與預(yù)計值相符，而空載體pBVIL1對照表達17103的蛋白條帶。融合蛋白主要以包涵體形式表達（圖2）。 我們對不同的誘導(dǎo)條件進行了摸索，如誘導(dǎo)時的菌液濃度、誘導(dǎo)培養(yǎng)時間等。，42℃誘導(dǎo)5h為最佳條件,進行重組蛋白的大量誘導(dǎo)表達與純化。采用Ni柱法純化目的蛋白，洗脫峰中的目的蛋白純度較高（圖3）。 ELISPOT檢測免疫小鼠IFNγ ELISPOT結(jié)果示意圖見圖4。檢測結(jié)果顯示：A組（重組蛋白Tat+T免疫組）產(chǎn)生的斑點數(shù)明顯多于B組（重組蛋白T免疫組）和PBS對照組，差異有顯著性（P）。含Tat融合肽的重組蛋白Tat+T比不含Tat融合肽的重組蛋白T產(chǎn)生的細胞免疫反應(yīng)水平高（圖5）。圖1 原核表達載體pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T的構(gòu)建示意圖 3 討論 如何評價腫瘤抗原特異性T細胞反應(yīng)，是抗腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)。從T細胞免疫反應(yīng)檢測的方法來看，ELISPOT法是近年來逐步建立起來的通過檢測細胞因子來評價T淋巴細胞功能和特異性的新方法，可檢測單細胞水平上的細胞因子產(chǎn)生、分泌情況。這一方法的特異性和敏感性都很高，廣泛應(yīng)用于CTL表位鑒定，疫苗療效監(jiān)測［10～14］。自從首次發(fā)現(xiàn)TatPTD的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性以來［15～17］，這一特性為將目的分子引入細胞提供了一條嶄新的途徑。蛋白疫苗形式雖然安全可靠，但較難引發(fā)CTL細胞免疫反應(yīng)，究其原因與外源蛋白通常進不了細胞而不能進入MHC類分子介導(dǎo)的抗原呈遞途徑有關(guān),這也極大地限制了利用重組蛋白疫苗來誘發(fā)CTL免疫應(yīng)答的研究。Kim等［18］將卵清蛋白(OVA)與TatPTD融合,加入到APC體外培養(yǎng)細胞后,融合蛋白跨膜導(dǎo)入細胞并進入MHCⅠ類分子介導(dǎo)的抗原呈遞途徑,從而激活了CD8＋的T淋巴細胞，而且用TatPTD融合蛋白免疫小鼠后也可激發(fā)抗原特異性CTL的免疫應(yīng)答。此項研究拓展了重組蛋白疫苗的應(yīng)用范圍,有望在激活體液免疫的同時激活細胞免疫。研究表明TatPTD融合蛋白可改善基于蛋白質(zhì)的腫瘤免疫治療，為腫瘤亞單位疫苗提供了新的研究策略［17］。本研究中應(yīng)用TatPTD融合蛋白免疫動物，確實能有效誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)，ELISPOT斑點數(shù)優(yōu)于不含TatPTD的蛋白組。以上結(jié)果表明，TatPTD融合形式的復(fù)合表位在腫瘤免疫治療中有很好的應(yīng)用前景。關(guān)于ELISPOT試驗技術(shù)中對細胞的處理(轉(zhuǎn)載自丁香園)(20090427 11:14:39)標(biāo)簽：雜談 一、提取外周血淋巴細胞時注意事項如果取外周血淋巴細胞 (PBMC) 進行ELISPOT檢測，最好采用新鮮血液。在保證無菌操作的前提下，首先應(yīng)保證取血時抗凝劑應(yīng)及時充分的與血液混勻，避免血凝塊的出現(xiàn)。抗凝血最好及時提取PBMC，避免放置時間過長，室溫下避免過夜。應(yīng)選用分離效果好的淋巴細胞分離液，避免PBMC中混有過多其他細胞成分或雜質(zhì)。外周血出現(xiàn)溶血后，在使用淋巴細胞分離液分離PBMC時，溶血產(chǎn)生的細胞碎片、血紅素等雜質(zhì)將極大可能懸浮于分離液的層面，在吸取PBMC時非常容易混入這些雜質(zhì)，由于混入細胞的細胞碎片和血紅素很難清洗去除，在進行ELISPOT實驗時，有可能沉積在培養(yǎng)板底，嚴(yán)重影響細胞因子和抗體的結(jié)合，進而影響實驗結(jié)果。使用淋巴細胞分離液，推薦使用進口淋巴細胞分離液，如：Lymphoprep，或者NycoPrep （無寡糖）。避免使用紅細胞裂解液分離淋巴細胞。二、從動物脾臟組織分離淋巴細胞取動物脾臟組織時，應(yīng)注意取材的無菌操作。分離出脾臟組織，研磨后過200目篩網(wǎng)，保證所分離的細胞為單個細胞懸液。獲得細胞懸液后應(yīng)該使用相應(yīng)的淋巴細胞分離液進一步分離單個核細胞。三、在ELISPOT板上，每孔我應(yīng)該放置淋巴細胞的數(shù)目在使用ConA，PHA等陽性刺激孔中，一般放置的淋巴細胞數(shù)為 104～2105。在使用抗原作為刺激劑的情況下，每孔細胞濃度可在1～4105。在使用多克隆刺激劑的情況下，應(yīng)適當(dāng)調(diào)低細胞濃度。但由于所用刺激劑的強度和批號不同，建議初次進行ELISPOT檢測時，對刺激劑濃度和細胞濃度設(shè)立梯度，以保證較理想的實驗結(jié)果。四、對淋巴細胞進行體外刺激預(yù)孵育、或板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)將抗原和淋巴細胞在體外混合，刺激并預(yù)孵育，是通用的方法。預(yù)孵育的淋巴細胞，在置入ELISPOT板之前應(yīng)使用復(fù)溫到37℃的培養(yǎng)液清洗細胞12次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培養(yǎng)5～6小時。對于高度特異性抗原，可以采用將淋巴細胞和抗原同時加入ELISPOT板孔中，37℃培養(yǎng)箱中，同步進行刺激、培養(yǎng)、和細胞因子捕獲。淋巴細胞板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)的時間通常為22～24小時。ELISPOT試驗檢測的是每一個分泌細胞因子的活化細胞。在培養(yǎng)細胞過程中，任何移動、震動（包括開關(guān)培養(yǎng)箱門）都會導(dǎo)致細胞在培養(yǎng)板上的移動，從而得到不規(guī)則斑點或者斑點花紋，影響最終結(jié)果。因此細胞在ELISPOT培養(yǎng)板孵育的過程中，應(yīng)注意保持培養(yǎng)板的靜置，不應(yīng)對其移動。在使用抗原刺激淋巴細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃，這種現(xiàn)象通常見于使用很強的多克隆抗原刺激淋巴細胞，某些多克隆抗原會導(dǎo)致淋巴細胞凋亡或者死亡，大量淋巴細胞死亡后使培養(yǎng)液變黃。使用這些淋巴細胞進行后續(xù)ELISPOT試驗通常得到很低的斑點（SPOT）形成。換用特異性抗原后可以避免該現(xiàn)象。在ELISPOT結(jié)果中出現(xiàn)不規(guī)則的大塊斑點，有的區(qū)域沒有斑點的原因，不規(guī)則斑點區(qū)域的出現(xiàn)一般是細胞分離不完全所至，有時候采用多克隆抗原孵育的淋巴細胞也會產(chǎn)生成團現(xiàn)象。請確認加入到ELISPOT板中進行孵育的是單細胞懸液。使用開口較大的吸頭，動作輕柔，避免對細胞的吹打，減少剪切力對淋巴細胞的傷害。